全反式维甲酸对糖尿病肾病模型大鼠转化生长因子β1基因甲基化水平影响的实验研究

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对糖尿病肾病(DN)模型转化生长因子β1(TGF-β1)基因甲基化水平的影响。方法:将30只成年雄性SD大鼠随机分为对照组、DN组、DN+ATRA组,每组10只。采用高糖高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素建立DN大鼠模型,对照组和DN组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃,DN+ATRA组给予5 mg/kg ATRA灌胃,连续干预4周。观察各组大鼠24 h尿蛋白和血液生化指标,肾脏组织行HE染色和PAS染色,选择MS-PCR检测各组大鼠肾脏中TGF-β1基因的DNA甲基化水平,选择逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、Western blot法及免疫组织化学检测肾脏组织TGF-β1 mRNA及蛋白表达。结果:与对照组比较,DN组大鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、24 h尿蛋白升高(均P<0.05)。与DN组比较,DN+ATRA组大鼠FBG、BUN、Scr、24 h尿蛋白降低,但高于对照组(均P<0.05)。HE染色和PAS染色DN组肾小球形状不规则,系膜基质增多着玫瑰红色,部分肾小管有萎缩且存在管腔扩张,肾小管周围有较多炎症细胞浸润和组织增生,DN+ATRA组大鼠肾脏组织病变情况明显减轻。DN组大鼠肾脏组织TGF-β1基因的DNA甲基化水平相较于对照组显著降低,DN+ATRA组大鼠肾脏组织TGF-β1基因的DNA甲基化水平相较于DN组显著升高(P<0.05)。对照组大鼠肾脏组织TGF-β1mRNA及蛋白水平显著低于DN组,DN+ATRA组大鼠肾脏组织TGF-β1mRNA和蛋白水平显著高于对照组,低于DN组(均P<0.05)。结论:ATRA能通过升高TGF-β1基因的DNA甲基化水平,抑制DN大鼠肾脏组织TGF-β1mRNA和蛋白表达,改善DN大鼠肾脏组织的纤维化程度。

沙格列汀联合二甲双胍对2型糖尿病小鼠肾脏保护作用及对氧化还原平衡的影响

目的观察沙格列汀联合二甲双胍对2型糖尿病(T2DM)小鼠肾脏保护作用及对氧化还原平衡的影响。方法高脂喂养C57BL/6J小鼠并腹腔小剂量注射STZ建立T2DM小鼠模型,随机分为T2DM组、格列苯脲组(Gli组)、二甲双胍组(Met组)、沙格列汀组(Sax组)、沙格列汀+二甲双胍组(S+M组),并设正常对照组(NC组),每组各8只。小鼠干预8周后称重,留取血尿及肾组织标本测定GHbA1c、FBG、Alb、8-OHdG、8-iso-PG、SOD、GSH、GSSG和Ucr,观察各组肾组织病理形态。结果沙格列汀联合二甲双胍干预治疗后能明显降低Alb/Ucr(UACR)、8-OHdG/Ucr(UOCR)、8-iso-PG/Ucr(UPCR)水平,提高SOD活性及GSH/GSSG比值,改善肾脏组织病理变化,且优于Met组和Sax组。结论沙格列汀联合二甲双胍对2型糖尿病小鼠肾脏有协同保护作用,其机制部分与减轻氧化应激,改善机体氧化还原平衡有关。

斜纹夜蛾SlSCP-2真核表达载体的构建及对胆固醇的吸收

构建pcDNA5/FRT-SlSCP-2和阳性对照pcDNA5/FRT-GFP真核表达载体,将斜纹夜蛾固醇转运蛋白SlSCP-2和绿色荧光蛋白GFP分别整合进入Flp-In^(TM)CHO细胞基因组中的FRT位点上,利用western blotting方法和荧光倒置显微镜观察鉴定SlSCP-2和GFP蛋白在CHO细胞的表达情况.结果表明,重组质粒瞬时转染CHO细胞24h后,pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP均能正确表达目的蛋白,SlSCP-2能够增加细胞对胆固醇的吸收.同时确定了筛选稳定转染细胞株合适的潮霉素浓度.

灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体制备及组织表达分析

【目的】制备灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)固醇转运蛋白(SCP)的多克隆抗体,并检测灰茶尺蠖SCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况,为进一步研究SCP2对胆固醇的转运和利用机制以及其生物学功能奠定基础。【方法】以灰茶尺蠖5龄1d幼虫中肠cDNA为模板,应用PCR技术扩增得到EgSCP2片段,将EgSCP2目的片段连入pMD18-T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的分子质量。以测序正确的EgSCP2基因片段为模板,扩增EgSCP2的开放阅读框,通过BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶连接到原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,离心收集并超声波破碎菌体,取上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE检测,在不同温度、不同IPTG终浓度条件下优化EgSCP2重组蛋白表达条件。经Ni-NTA树脂层析柱纯化得到EgSCP2重组蛋白。将该蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗EgSCP2血清抗体,采用间接ELISA方法测定了该血清抗体的效价,并通过Westernblotting检测EgSCPx和EgSCP2蛋白在灰茶尺蠖不同组织中的表达情况。【结果】扩增得到EgSCP2基因开放阅读框(ORF)全长为441bp,编码146个氨基酸,预测编码蛋白的分子质量为16ku。优化蛋白诱导条件的试验表明,28℃、IPTG浓度为1.0mmol/L时,EgSCP2重组蛋白表达量最高,该条件下通过大肠杆菌表达的EgSCP2重组蛋白分子质量约为34ku,其大小与预期结果一致,且其在上清液和沉淀中均有表达。间接ELISA法检测结果表明,制备的兔抗EgSCP2抗体具有较好的灵敏度,效价达到1∶256000。Westernblotting检测结果显示,58kuEgSCPx在5龄2d灰茶尺蠖的表皮、脂肪体和中肠均有表达,且在中肠的表达量远高于表皮和脂肪体;16kuEgSCP2仅在表皮和脂肪体中表达。58kuEgSCPx蛋白在4龄和5龄灰茶尺蠖的幼虫中肠大量表达,在蛹期少量表达,在成虫期几乎不表达。【结论】纯化获得了EgSCP2重组蛋白,其最优表达条件为温度28℃、IPTG终浓度1.0mmol/L;制备了高效价的灰茶尺蠖EgSCP2多克隆抗体,明确了灰茶尺蠖EgSCPx蛋白在不同组织中的表达规律。

沙格列汀对2型糖尿病模型小鼠肾组织单核细胞趋化蛋白1表达的影响

目的观察沙格列汀对2型糖尿病(T2DM)模型小鼠肾脏的保护作用及其对肾组织单核细胞趋化蛋白(MCP)-1表达的影响。方法将38只8周龄C57BL/6J小鼠分为正常对照组(n=8,常规饲料喂养)和高脂喂养组(n=30)。连续饲养4个月后,给予高脂喂养组小鼠链脲佐菌素(STZ)45 mg·kg^(-1)·d^(-1)腹腔注射,共3 d。选取造模成功小鼠24只,随机分成模型组、格列本脲组和沙格列汀组,每组8只,每日分别灌胃给予无菌生理盐水、格列本脲(2.5 mg·kg^(-1))和沙格列汀(5 mg·kg^(-1))。8周后称重,检测尿白蛋白(ALB)、视黄醇结合蛋白(RBP)、足细胞标志蛋白(PCX)、MCP-1和空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA_(1c))水平和肾组织MCP-1蛋白及m RNA表达情况,并观察肾组织病理学改变。结果与正常对照组比较,模型组小鼠体重降低,FBG、HbA_(1c)和尿ALB、RBP、PCX和MCP-1水平均升高,肾组织MCP-1蛋白和mRNA表达水平升高,差异均有显著意义(P<0.05),且模型组小鼠肾脏病理损伤及炎症明显加重。与模型组比较,格列本脲组、沙格列汀组小鼠体重升高,FBG、HbA_(1c)和尿ALB、RBP和MCP-1降低,肾组织MCP-1蛋白和m RNA表达水平降低,均差异显著(P<0.05),沙格列汀组尿PCX也显著降低(P<0.05),且沙格列汀组尿ALB、RBP、PCX、MCP-1以及肾组织MCP-1蛋白和m RNA水平低于格列本脲组(P<0.05),肾脏病理损伤及炎症明显减轻,小鼠体重、FBG和HbA_(1c)组间比较无显著差异(P>0.05)。结论沙格列汀可减轻T2DM小鼠肾脏损伤,这可能与其下调肾组织MCP-1的表达有关。

沙格列汀联合二甲双胍对2型糖尿病小鼠肾小球足细胞保护作用及其与抗氧化的关系

目的 观察沙格列汀联合二甲双胍对T2DM小鼠肾小球足细胞保护作用及其与抗氧化的关系。方法 高脂喂养C57BL/6J小鼠联合小剂量腹腔注射STZ建立T2DM小鼠模型,随机分为T2DM组、二甲双胍组[Met,250 mg/(kg·d)]、沙格列汀组[Sax,5 mg/(kg·d)]、沙格列汀+二甲双胍组[S+M,250 mg/(kg·d)+5 mg/(kg·d)],另设正常对照(NC)组,每组各8只。干预8周后称重,测定糖化血红蛋白(GHbA1c)、FPG、UAlb、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、8-异前列腺素(8-iso-PG)、足细胞标志蛋白(PCX)和尿肌酐(Ucr),计算UACR、8-OHdG/Ucr、8-iso-PG/Ucr、PCX/Ucr。电镜观察各组肾脏足细胞病理变化,计算各组肾脏足突融合率(FPFR)。结果 与NC组比较,T2DM、Met、Sax、S+M组体重降低(P<0.05),GHbA1c、FPG、UACR、8-OHdG/Ucr、8-iso-PG/Ucr、PCX/Ucr和FPFR升高(P<0.05)。与T2DM组比较,Met、Sax、S+M组体重升高(P<0.05),GHbA1c、FPG、UACR、8-OHdG/Ucr、8-iso-PG/Ucr、PCX/Ucr和FPFR降低(P<0.05)。与Met、Sax组比较,S+M组UACR、8-OHdG/Ucr、8-iso-PG/Ucr、PCX/Ucr和FPFR降低(P<0.05)。结论 沙格列汀联合二甲双胍对T2DM小鼠肾小球足细胞有协同保护作用,其机制可能与其协调减轻氧化应激相关。

达格列净对2型糖尿病小鼠的肾脏保护作用及其对血管内皮生长因子表达影响的研究

目的观察钠-葡萄糖共转运体2(SGLT-2)抑制剂达格列净对T2DM小鼠肾脏保护作用及其机制。方法高脂饲养C57BL/6J小鼠并腹腔小剂量注射STZ建立T2DM小鼠模型,随机分为T2DM组、达格列净组[Dap,10 mg/(kg·d)]、格列苯脲组[Gli,2.5 mg/(kg·d)],并设置正常对照(NC)组,每组各8只。小鼠干预8周后称重,留取血尿标本测定FPG、小鼠糖化血红蛋白(GHbA1c)、FIns、UAlb、ɑ1-微球蛋白(ɑ1-MG)、视黄醇结合蛋白(RBP)、TH-糖蛋白(THP)、podocalyxin(PCX)和VEGF,检测肾组织VEGFA蛋白及mRNA表达水平。结果与NC组比较,T2DM、Gli、Dap组体重降低(P<0.05),FPG、GHbA1c、FIns、HOMA-IR、UACR、RBP/Ucr(URCR)、ɑ1-MG/Ucr(UMCR)、THP/Ucr(UTCR)、PCX/Ucr(UPCR)和VEGFA/Ucr(UVCR)升高(P<0.05)。与T2DM组比较,Gli、Dap组FPG、GHbA1c、HOMA-IR、UACR、URCR、UTCR降低(P<0.05),Gli组体重升高(P<0.05),Dap组FIns、UMCR、UPCR和UVCR降低(P<0.05)。与Gli组比较,Dap组体重、FIns、HOMA-IR、UACR、URCR、UMCR、UTCR和UVCR降低(P<0.05)。与NC组比较,T2DM、Gli组炎症细胞数量、VEGFA m RNA升高(P<0.05)。Dap组炎症细胞数量、VEGFA mRNA低于T2DM、Gli组(P<0.05)。与NC组比较,T2DM、Gli、Dap组VEGFA蛋白表达降低[(1.00±0.26)vs(0.12±0.11)vs(0.12±0.27)vs(0.43±0.72),P<0.05]。Dap组VEGFA蛋白表达高于T2DM、Gli组(P<0.05)。结论达格列净对T2DM小鼠肾脏损伤有保护作用,且恢复肾组织VEGF表达异常,该作用可能与其肾脏保护部分相关。