基于小鼠骨骼肌损伤模型分析丹参素对骨骼肌损伤后修复再生的促进作用

旨在探明丹参单体成分丹参素在骨骼肌损伤后修复中的作用,以期为临床治疗提供理论依据。本试验建立骨骼肌损伤模型,设置丹参素治疗组,通过HE染色和Masson染色观察肌纤维修复过程,Western blot和QPCR方法检测肌再生相关因子(α-Actinin、eMyHC、MyoD、MyoG、Pax7和MSTN),炎症相关因子(IL-6和IL-10),巨噬细胞类型相关因子(F4/80),瘢痕组织形成相关因子(CollagenⅠ和α-SMA)及肌间脂肪相关因子PPAR-γ的表达。结果显示,丹参素降低损伤组腓肠肌对Evans blue的摄取,显著增加α-Actinin和eMyHC因子的表达水平。与损伤组相比,肌肉再生相关因子MyoD、MyoG和Pax7的表达水平在丹参素治疗之后显著升高,而MSTN显著减少。丹参素显著降低损伤组F4/80的表达,加快M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化,降低IL-6 mRNA水平,增加IL-10 mRNA水平。Masson染色结果显示,丹参素减少受损骨骼肌胶原纤维的分布,并且降低CollagenⅠ和α-SMA的表达。同时,丹参素显著增加肌间脂肪因子PPAR-γ的表达。因此,丹参素能够加快肌纤维的再生,促进肌间脂肪的形成,减少纤维化瘢痕的生成,从而加快骨骼肌修复进程,提高骨骼肌修复质量。

GDF 11 通过 AKT 通路抑制骨骼肌细胞分化

[目的]探究骨骼肌GDF11(生长分化因子11,Growth and differentiation factor 11)在生长发育过程中的表达情况及其作用,明确GDF11在骨骼肌细胞中激活的非SMAD调控通路,为抵抗骨骼肌衰老、促进骨骼肌损伤修复,探究肌肉发育调控的相关机制提供理论参考。[方法]以不同发育阶段小鼠和C2C12细胞为材料,取不同发育阶段小鼠腓肠肌、使用分化培养基诱导细胞分化、使用D⁃半乳糖诱导C2C12细胞衰老,分别探究GDF11在个体层面和细胞层面骨骼肌生长发育和衰老中的表现和作用;通过构建GDF11的过表达载体和siRNA载体,观察GDF11对C2C12细胞成肌分化的影响,并检测了在这一过程中细胞内相关基因的变化,探究GDF11在骨骼肌细胞发育中影响;通过对AKT信号通路的抑制,明确GDF11在骨骼肌细胞分化过程中激活的非SMAD调控通路。[结果](1)在小鼠腓肠肌中,GDF11蛋白表达量随着年龄的增长呈现出先下降后上升的趋势。(2)在细胞分化前期GDF11表达量逐渐升高,并在3 d时细胞开始分化时达到最高,随后逐渐降低,7 d时恢复到与初始相似的水平。(3)随着D⁃半乳糖浓度的增加,细胞衰老程度逐渐增加,同时细胞GDF11表达量逐渐增加。(4)过表达GDF11使细胞分化进程推迟,但抑制GDF11的表达对细胞分化进程并没有影响。过表达GDF11上调了AKT的磷酸化水平。(5)过表达GDF11的C2C12细胞中阻断AKT通路能够逆转GDF11造成的分化抑制。[结论](1)小鼠骨骼肌中的GDF11表达量与小鼠年龄和成肌细胞分化有关。(2)GDF11能够抑制C2C12细胞成肌分化。(3)GDF11抑制C2C12细胞分化的过程与激活AKT信号通路相关。

羊驼垂体催乳素(PRL)基因全长cDNA的克隆及序列分析

获得并分析羊驼PRL基因cDNA全序列结构,为研究羊驼催乳素(PRL)的各种生物学作用和生产应用提供理论依据。根据已知的不同哺乳动物的PRL基因cDNA序列,设计羊驼PRL引物,运用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得羊驼PRL基因cDNA全序列。羊驼PRL基因cDNA序列全长959bp,编码区为687bp,编码229个氨基酸的PRL前体蛋白。预测羊驼PRL蛋白质的空间结构类似人生长激素(GH),但在81位(成熟肽为51位)为蛋氨酸可能导致蛋白空间结构的不同而影响羊驼PRL的功能;序列比对结果表明,羊驼PRL的cDNA序列与大多数哺乳动物相似。构建的基因进化树分析结果显示,羊驼PRL与骆驼的亲缘关系最近;同多数哺乳动物一样,羊驼PRL进化速度极缓慢,没有发生人、灵长类、啮齿类、反刍动物的"episodic"式进化。

饲料掺假原料中非蛋白氮的快速检测方法探讨

本文主要探究饲料掺假原料中主要几种非蛋白氮的快速定性检测方法,包括尿素、铵盐、硝酸盐-亚硝酸盐、尿醛聚合物、生物蛋白精、三聚氰胺的快速定性检测。快速定性检测方法在实际原料掺假检测工作中与其标准检测方法比较更简便、经济、实用、结果直观、选择性强,是一种实用性强、易推广的饲料掺假原料中非蛋白氮的检测方法。

MyoD在不同发育阶段小鼠心肌的表达定位

[目的]为了探讨小鼠MRFs基因家族中MyoD基因与心肌细胞增殖分化之间的关系,[方法]本研究对幼年、性成熟、体成熟、老年4组小鼠心肌MyoD基因的表达进行研究。取小鼠心肌组织,采用实时荧光定量PCR技术检测MyoD mRNA在不同发育阶段小鼠心肌的表达,免疫组织化学法定位MyoD在心肌中的分布。[结果]HE染色显示幼年鼠肌纤维排列紧密,细胞核中心化现象多见,随着年龄增长,肌纤维排列疏松,细胞核中心化现象少见,老年鼠稍有回升。免疫组化MyoD在幼年小鼠中表达量最高,性成熟、体成熟、老年鼠中MyoD表达量均低于幼年鼠。其中性成熟小鼠表达量高于体成熟小鼠和老年小鼠。MyoD在小鼠的不同发育阶段心肌上均有表达,其中在幼年阶段心肌上的表达最显著,而在性成熟阶段和体成熟阶段心肌上的表达降低,老年阶段表达稍有回升,且差异显著。[结论]MyoD对于肌肉的形成有重要的作用,尤其是在胚胎发育早期。MyoD表达量与小鼠心肌细胞的发育具有相关性,即MyoD在不同发育阶段小鼠心肌细胞的表达存在差异性,可以作为判断肌细胞发育程度的一种指标,为进一步研究肌肉作用机制提供理论依据。

MyoD在不同发育阶段小鼠骨骼肌中的表达与定位

本试验旨在研究Myo D基因在不同发育阶段小鼠骨骼肌上的表达量及表达位置。我们采用了固定切片、H.E.染色、RNA提取、实时荧光定量以及免疫组织化学方法进行分析。结果显示Myo D基因在幼龄小鼠的骨骼肌中表达量最高,在老龄小鼠体内的表达量次之,在体成熟小鼠体内的表达量最低。分析表明Myo D基因在不同发育阶段小鼠骨骼肌上表达存在差异,其与骨骼肌的发育存在相关性,结果将为后续研究Myo D提供理论依据。

黑色素细胞中过量表达miR-137对TYRP-1和TYRP-2的影响

【目的】证明miR-137通过调控MITF而间接影响小鼠黑色素细胞TYRP-1和TYRP-2的表达,从而影响黑色素的生成。【方法】通过细胞转染技术在细胞水平过量表达miR-137,对黑色素细胞中黑色素含量进行了测定,经RT-PCR以及western blot检测转染后细胞TYRP-1和TYRP-2在mRNA和蛋白水平的变化。【结果】黑色素含量明显减少,在mRNA水平,TYRP1显著降低至0.4倍,TYRP-2显著降低至0.6倍。在蛋白水平,TYRP-1显著降低至0.61倍,TYRP-2显著降低至0.73倍。【结论】过量表达miR-137会通过调控MITF而使黑色素细胞TYRP-1和TYRP-2的表达量降低,从而揭示了miR-137通过调节TYRP-1和TYRP-2的表达间接调控了黑色素的生成。

肌肉生长抑制素在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达

本试验旨在探究肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中的表达情况,分别选取幼年(7日龄)、性成熟(21~28日龄)、体成熟(42~56日龄)和老年(84日龄以上)4个发育阶段的健康小鼠(各3只)为研究对象,采用实时荧光定量PCR、HE染色、免疫组织化学等方法研究小鼠不同发育时期MSTN基因在心肌组织中的表达及不同时期心肌组织的发育。实时荧光定量PCR结果显示,MSTN基因在小鼠不同发育阶段心肌组织中均有表达,且其在小鼠老年时期的表达量最高,体成熟时期的表达量最低;幼年小鼠和性成熟小鼠心肌组织中MSTN基因表达水平显著低于老年小鼠(P<0.05),而体成熟小鼠则极显著性低于老年小鼠(P<0.01)。HE染色结果显示,小鼠心肌细胞核及肌纤维的生长在不同发育时期明显不同,其中幼年时期的细胞核最多,肌纤维排列相对较紧密,而在性成熟、体成熟、老年时期心肌的发育指标依次降低。免疫组织化学结果显示,MSTN基因主要在心肌细胞核中表达,其各个时期表达量与实时荧光定量PCR的结果相符合。

红薯叶中水溶性膳食纤维提取工艺优化

采用超声波法提取红薯叶中的水溶性膳食纤维,考察柠檬酸质量分数、料液比、超声功率和时间、提取温度等单因素对提取效果的影响,并采用Box-Benhnken中心组合实验设计和响应面分析法优化提取工艺。结果表明,红薯叶中水溶性膳食纤维最佳提取条件为:柠檬酸质量分数4%,料液比1∶35,超声波功率240 W,超声时间21 min,提取温度60℃,在此条件下水溶性膳食纤维的得率为4.37%±0.04%。该方法操作简便,周期短,提取效果较好。

Slc45a2调控小鼠黑色素细胞色素生成

膜相关转运蛋白Slc45a2(solute carrier family 45 member 2)调节黑素体中的p H值,进而调节酪氨酸酶活性,在黑色素生成中发挥重要作用。小眼畸形转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)已被证实是Slc45a2的调节因子,然而其调控机制仍待研究。该研究旨在探讨Slc45a2在不同毛色小鼠皮肤是否存在差异表达,以及与毛色形成是否存在相关性。QRTPCR检测显示,Slc45a2在不同毛色小鼠皮肤样品中均有表达,在棕色和灰色小鼠皮肤中Slc45a2的表达量是黑色小鼠皮肤的6.29倍(P<0.01)和1.18倍(P<0.05);Western印迹结果显示,在棕色和灰色小鼠皮肤中Slc45a2蛋白表达量是黑色小鼠皮肤的1.44(P<0.01)和1.03倍;免疫组织化学结果表明,Slc45a2在不同毛色皮肤毛囊的毛基质、内外毛根鞘、毛乳头等区域均有表达。为了进一步了解Slc45a2在黑色素细胞色素沉着的重要作用,将Slc45a2转染到小鼠黑色素细胞并测定黑色素含量,同时检测色素沉着相关基因的表达水平。结果表明,转染Slc45a2与空载组相比黑色素含量明显增加。此外,MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白水平分别升高1.31倍、1.37倍、1.63倍和2.21倍,差异显著(P<0.05);TYRP2蛋白显著升高2.47倍(P<0.01)。MITF mRNA显著升高1.64(P<0.05);TYR和TYRP1 mRNA显著升高2.96倍(P<0.01)和8.85倍(P<0.01);TYRP2 mRNA表达量变化不明显。Slc45a2在不同毛色小鼠皮肤中均可有效表达,且差异显著。Slc45a2过量表达,使色素沉着相关基因的表达量及黑色素含量增加。由此表明,Slc45a2通过调控色素的生成,进而影响毛色的形成。

响应面法优化桑葚果渣中白藜芦醇的提取工艺

采用响应面法优化高压提取桑葚果渣中白藜芦醇的工艺条件。以白藜芦醇提取量为考察指标,在单因素试验的基础上,采用Box-Benhnken中心组合设计3因素3水平试验,以确定最佳提取参数。结果表明,最佳提取参数为:料液比1∶25(m/V)、乙醇浓度78%、提取压力270 MPa、提取时间5.5 min;在此条件下,白藜芦醇提取量可达(8.29±0.20)μg/g。

潞党参多糖的提取及含量测定

目的 :从潞党参中提取多糖并测定多糖含量。方法 :用水提醇沉法提取潞党参多糖 ;用苯酚 硫酸法测定其含量。结果 :测得潞党参中多糖含量为 2 0 .99% ,平均收回率为 99.0 3% ,RSD =1.0 1% (n =3)。结论 :潞党参中多糖含量较高 ,具有开发利用价值。

内皮素3对小鼠黑色素沉着相关基因表达的影响

试验旨在探究内皮素3(endothelin 3,EDN3)在不同毛囊时期小鼠皮肤中是否存在差异表达及其对黑色素细胞黑色素沉着相关基因表达的影响。通过RT-PCR技术对EDN3、EDNRB在不同毛囊时期小鼠皮肤的表达情况进行定量分析发现,EDN3和EDNRB在小鼠不同毛囊时期皮肤样品中均有表达,在毛囊生长初期和中期小鼠皮肤中EDN3 mRNA表达量是末期的2.18倍(P<0.05)和1.15倍(P>0.05),毛囊生长初期和中期EDNRB mRNA表达量是末期的16.8倍(P<0.01)和9.9倍(P<0.01)。为了进一步揭示EDN3在黑色素细胞色素沉着中的重要作用,通过细胞转染技术使小鼠黑色素细胞过表达EDN3并测定其黑色素含量及色素沉着相关基因的表达水平发现,与空载组相比,体外转染EDN3的黑色素细胞黑色素含量明显增加。此外,MITF mRNA显著降低(P<0.05);TYR、TYRP2、EDNRB、c-Kit和EDN1 mRNA显著升高2.04倍(P<0.05)、1.44倍(P<0.05)、1.41倍(P<0.05)、5.21倍(P<0.01)和3.27倍(P<0.01)。MITF蛋白水平显著降低(P<0.05),TYR、TYRP2、EDNRB和c-Kit蛋白水平显著升高1.48倍(P<0.01)、4.61倍(P<0.01)、1.27倍(P<0.05)和2.64倍(P<0.01)。综上所述,EDN3在不同毛囊时期小鼠皮肤中均可有效表达,且表达量存在显著差异。黑色素细胞中过量表达EDN3,使色素沉着相关基因的表达量及黑色素含量增加。

内皮素3在不同毛色小鼠皮肤中的表达与定位

内皮素3(endothelin 3,EDN3)对早期黑色素细胞的迁移及增殖分化有促进作用,并可通过与其受体结合促进黑色素的合成。EDN3在不同毛色小鼠皮肤中的差异及其在毛色形成过程中的作用仍有待研究。实时荧光定量PCR结果显示,灰色小鼠皮肤中EDN3的表达量显著高于黑色及棕色小鼠,约为其2倍(P<0.01)。蛋白免疫印迹结果显示,灰色小鼠皮肤内EDN3的含量为黑色小鼠的5倍,棕色小鼠为黑色小鼠的2倍。ELISA结果表明,灰色小鼠皮肤中EDN3的蛋白质表达量分别是黑色和棕色小鼠的1.8倍和1.4倍(P<0.01)。免疫组织化学显示,EDN3在毛囊的毛基质及内外毛根鞘有明显表达,毛乳头等部位有少量表达。EDN3在不同毛色小鼠皮肤中的表达存在显著差异,是维持黑色素细胞存在不可缺少的因子,可能对两种色素颗粒的相互转化有一定的作用。

GPNMB通过调控MITF下游色素相关基因表达影响黑色素细胞色素的生成

【目的】探究GPNMB是否会通过调控MITF及其下游色素相关基因的表达来影响黑色素细胞中色素的生成,为进一步阐明GPNMB对黑色素细胞中色素生成的具体机制提供理论依据。【方法】首先对小鼠GPNMB核酸序列进行检索,通过对GPNMB和慢病毒表达载体序列分析来筛选出合适的酶切位点,在此选取SalⅠ和XbaⅠ作为酶切位点。并对GPNMB基因序列设计含有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点的全长引物,克隆GPNMB基因全长序列,将含有酶切位点的GPNMB基因片段与T载体进行连接,送华大基因测序。将构建成功的T载体提取质粒,双酶切后将其与含有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体相连接,送华大基因进一步测序确认。使用质粒中提试剂盒获得大量去内毒素的GPNMB慢病毒真核表达载体。通过体外培养小鼠黑色素细胞,选择细胞对数生长期利用细胞转染技术过量表达GPNMB。观察转染后黑色素细胞形态特征变化和绿色荧光蛋白的表达量,收集黑色素细胞,并对其进行转染效率验证,黑色素含量进行测定,以及经Real-time PCR和Western blot检测转染后PMEL、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的mRNA和蛋白的表达量。【结果】与正常组(Control)相比试验组(Vector-GFP-GPNMB)、空载组(Vector-GFP)中黑色素细胞的形态特征无明显变化,并且试验组、空载组的绿色荧光蛋白表达量显示5μg DNA/孔转染效率最高。相对于空载组和正常组,试验组的GPNMB mRNA和蛋白水平都显著的升高(P<0.01)。与空载组相比,试验组黑色素含量升高1.34倍,差异显著(P<0.01)。Real-time PCR检测结果显示,MITF mRNA显著降低2.25倍(P<0.01);PMEL mRNA显著升高1.59倍(P<0.05);TYRP1 mRNA显著升高2.35倍(P<0.01);TYRP2 mRNA显著升高1.60倍(P<0.01);TYR mRNA升高1.65倍和OA1 mRNA升高1.5倍,但变化不明显。Western blot检测结果显示,MITF蛋白显著降低1.59倍(P<0.01);TYR蛋白显著升高1.23倍(P<0.01);TYRP2蛋白显著升高4.35倍(P<0.01);OA1蛋白显著升高1.31倍(P<0.05);TYRP1蛋白升高1.05倍,但变化不明显。【结论】GPNMB过量表达使MITF下游基因PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达量增加,却使MITF的表达量降低,由此表明GPNMB可能受非MITF调控路径调节PMEL、TYR、TYRP1、TYRP2和OA1的表达,从而影响黑色素的生成。

酶法辅助提取海红果中的白藜芦醇

以海红果干粉为原料,通过单因素及正交试验,优化海红果中白藜芦醇的酶法辅助醇提工艺,采用比色法进行白藜芦醇的产量检测。结果表明,酶法辅助提取的适宜条件为:p H值4.75,酶解温度50℃,酶解时间120 min,纤维素酶添加量120 mg/g。在该最优条件下,白藜芦醇的产量可达到114.37μg/g,是常规醇提方法的1.72倍。

羊驼副性腺结构的组织化学研究

为了解羊驼的生殖生理特性,采用大体解剖与组织学方法对羊驼副性腺的形态结构进行了研究。结果显示,羊驼副性腺有前列腺和尿道球腺,没有精囊腺。尿道球腺呈圆形,位于坐骨弓处,前列腺位于尿生殖道起始部的背侧,每一腺体都有腺管开口于尿生殖道;羊驼副性腺的基本组织结构和其他哺乳动物相似,但有较小的差异。尿道球腺为有许多弯曲分枝的复管泡状腺,分泌物较为黏稠,PAS染色强阳性,呈鲜红色;前列腺为复管泡状腺,前列腺的分泌物是一种稀薄的蛋白样液,PAS染色阳性,染色较浅。结果证实,羊驼前列腺和尿道球腺可分泌较多的糖物质,使精子生存较长时间;羊驼繁殖慢的特点可能与其生存环境差,易造成流产或妊娠期长且为单胎有关,而并不是精液本身的问题。

油菜蜂花粉破壁前后的品质分析

对破壁前后油菜蜂花粉进行了花粉性状、营养成分及微生物状况分析。结果表明,未破壁的油菜蜂花粉颗粒呈椭球型颗粒状、黄色;破壁蜂花粉颗粒呈碎玻璃片状,浅黄色,细粉状。破壁后的花粉比破壁前的蜂花粉更甜,油腻感更强,且在口中更润滑。经过破壁后的蜂花粉中脂肪、可溶性糖、灰分和蛋白质含量均高于未破壁花粉,其中,脂肪增幅最大,为59.10%;灰分和蛋白质次之,分别为36.20%和30.83%;可溶性糖最低,为10.56%;而蜂花粉水分含量却下降了54.52%。破壁前后的蜂花粉完全符合蜂花粉的微生物标准,且细菌总数远小于国标要求。

在羊驼皮肤黑色素细胞中α-黑素细胞刺激素对诱导一氧化氮合酶的影响

为研究α-黑素细胞刺激素(α-Melanocyte stimulating hormone,α-MSH)对诱导型一氧化氮合酶(NOS2)在羊驼皮肤黑素细胞中的影响。采用体外培养正常羊驼皮肤黑素细胞,检测不同浓度α-MSH(0、10-9、10-8、10-7mol/L)对羊驼皮肤黑素细胞中诱导型一氧化氮合酶(NOS2)基因表达量的影响;检测不同浓度一氧化氮供体(SNP)(0、10-5、10-4、10-3mol/L)对羊驼皮肤黑素细胞中阿黑皮素原(POMC,α-黑素细胞刺激素的前体)基因表达量的影响。结果表明:α-MSH处理羊驼皮肤黑素细胞5 d后,NOS2mRNA表达量有降低趋势,10-8mol/L较为明显;SNP处理5 d后,POMCmRNA表达量无明显变化。α-MSH能诱导羊驼皮肤黑素细胞NOS2mRNA基因表达量降低。

小鼠卵细胞体外成熟培养及孤雌激活

[目的]利用小鼠卵母细胞体外成熟培养及3种激活方法(乙醇激活、氯化锶激活、乙醇—氯化锶激活)对小鼠卵母细胞进行了孤雌激活研究。[方法]小鼠经注射孕马血清促性腺激素(PMSG)48h后,摘取卵巢获得3级未成熟卵母细胞,在成熟培养液(M199100mL+丙酮酸钠2.2mg+双抗100IU/mL+LH2IU/mL+FCS10%)中对小鼠未成熟卵细胞进行体外成熟培养,获得的成熟卵母细胞分别在乙醇、氯化锶、乙醇—氯化锶不同激活剂中激活。[结果]A级卵母细胞成熟率为79%,B级卵母细胞成熟率为70%,C级卵母细胞成熟率为55%。A级卵母细胞使用氯化锶激活率可达80.0%,为最佳方法。[结论]A级卵母细胞成熟培养效果最好。孤雌激活氯化锶激活效果高于乙醇。