一种有效的黑曲霉启动子捕获探针的构建及其应用

启动子对基因的表达起着关键的作用,为获得黑曲霉强启动子,该文以柠檬酸生产菌株黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 10142为出发菌株,运用启动子捕获探针和基因重组技术筛选菌株高强度启动子,并确定其核心启动区域。结果显示:以红色荧光蛋白基因(Rfp)为报告基因,潮霉素抗性基因(HygR)为筛选标记,构建黑曲霉启动子捕获探针质粒pN3,借助T-DNA随机整合到黑曲霉基因组,筛选具有高潮霉素抗性和强红色荧光表型的突变株,进而通过交错热不对称链式聚合酶反应(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,Tail-PCR)获得整合位点上游核苷酸序列,测序确定该序列为糖苷水解酶基因启动子区(Pgh),通过分析其具有多个转录因子结合元件。对Pgh启动子进行5'端缺失分析,获得6个不同长度5'端缺失的启动子序列,并与强启动子PglaA对比,根据报告基因Rfp表达情况确定启动子Pgh的-1 066~-766 bp为其核心区域。

一株产L-苹果酸黑曲霉菌株的诱变筛选及发酵培养基优化

为筛选一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,通过紫外诱变与高浓度放线菌酮迭代诱变的方法,将野生型菌株诱变为一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉菌株,并对其种子或发酵培养基成分进行优化。结果表明,诱变所得一株产L-苹果酸能力强的黑曲霉CGMCC NO.40550菌株,其摇瓶发酵时种子培养基最适葡萄糖浓度为60 g/L、最适氮源为(NH_4)_2SO_4 4.95 g/L,黑曲霉菌球形成最优转速220 r/min;发酵培养基最适葡萄糖和最适(NH_4)_2SO_4浓度分别为180 g/L和4.95 g/L,Cu SO_4·5H_2O为其生产苹果酸最佳微量元素,最适添加量为0.065 g/L。通过单因素实验的优化,优化后的培养基更有利于L-苹果酸的合成,发酵96 h时L-苹果酸产酸量达到18.15 g/L,显著提高了245%,L-苹果酸占总酸的百分比达到71.69%。本研究为L-苹果酸的工业化生产奠定基础。

过表达kojR高产曲酸米曲霉的转录组差异分析

曲酸是一种真菌次生代谢产物,在化妆品、食品和制药工业中有多种用途。为揭示米曲霉发酵生产曲酸的生物合成机制,该研究利用基因工程的手段获得一株kojR过表达菌株T58号,摇瓶发酵曲酸产量最高达到29.54 g/L,较原始米曲霉菌株3.042的10.12 g/L提升191.9%。将发酵过程中获得的菌株T58与3.042菌丝体进行转录组分析,发现两者之间存在2450个显著差异表达基因,其中1203个基因表达上调,1247个基因表达下调。菌株T58差异性表达量最高的前20个基因中,上调基因主要为不同类别的氧化还原酶,与氮源利用相关基因的转录水平显著下调。基因本体数据库分析显示,与转运活性相关的差异基因数量最多。

高效降解高盐高油餐厨垃圾微生物的筛选与应用

好氧处理法是一种有效的餐厨垃圾处理方法。借助摇瓶恒温振荡培养模拟生化处理的降解过程,从实验室所保存的高产酶菌株库中,筛选出在20 h可高效降解餐厨垃圾90%以上固型物的6株菌(BLE、BI1、BI2、LZM-B、B10-5和WL-BA-1),其中BLE和BI2两菌株可在20 h高效降解>90%的含有5.0%盐和6.0%油的餐厨垃圾;再者,经稳定性试验验证,菌株BLE和BI2连续12批次仍可对餐厨垃圾稳定降解,二者降解率均高于90%。经过分子生物学鉴定,确定BLE与BI2菌株均为Bacillus amyloliquefaciens。最后,对BLE和BI2菌株不同时间产生的水解酶进行分析,发现2株菌在发酵24 h内产酶均达到峰值,这是它们快速高效降解餐厨垃圾的重要原因。该研究可为餐厨垃圾快速减量化提供技术支持。

一种海洋几丁质酶产生菌的筛选及酶学性质研究

海洋是自然界几丁质主要来源地,滋养出种类繁多可降解几丁质的微生物,因此从海洋中筛选产高活性几丁质酶的细菌,是获得高产几丁质酶微生物的有效途径。该文以胶体几丁质为唯一碳源,从渤海滩涂筛选到一株具有降解几丁质特性的细菌Y-8,对其进行鉴定并研究其几丁质酶酶学性质。Y-8菌株经分子鉴定为副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),发酵上清液经SDS-PAGE及蛋白质谱分析,发现其存在2种几丁质酶,分别为Chi1几丁质外切酶,氨基酸残基数为848,理论分子质量为87.6 kDa;Chi2几丁质内切酶,氨基酸残基数为1054,理论分子质量为112.9 kDa。Y-8所产生的几丁质酶能够高效降解胶体几丁质,获得单一产物N-乙酰氨基葡萄糖,其最适反应温度为55℃,45℃保温1 h,仍能保持70%以上活性;最适pH为6.0,在pH 4.0~9.0、37℃保温1 h后相对酶活性保留55%以上,具有较好的稳定性。10 mmol/L的Mn 2+能使几丁质酶活性提高362%,而EDTA以及SDS、吐温-20、吐温-80对酶活力具有抑制作用。

分光光度法快速测定衣康酸

衣康酸是通过微生物发酵生产的一种有机酸,广泛应用于化工和医药领域。该文基于衣康酸和高锰酸钾发生的氧化还原反应,建立高锰酸钾分光光度法快速测定衣康酸浓度的方法。该测定方法最大检测波长540 nm,高锰酸钾(2.50 g/L)2.0 mL,样品1 mL,反应温度30℃,反应时间30 min。衣康酸浓度在0.12 g/L~0.36 g/L的范围内,吸光度与浓度呈现线性关系。利用此方法测定衣康酸浓度,相关系数R^(2)为0.995 3,测得的相对标准偏差在±5.00%范围内,回收率在100.00%~101.11%之间,结果可信。该方法可用于快速测定发酵液中衣康酸的浓度。

丝状真菌全局转录调控因子研究现状及发展

丝状真菌的次级代谢产生的有益或有害于人类的代谢产物,已成为生物医药和食品发酵领域的研究热点。丝状真菌的次级代谢是一个复杂的、多层次的调控过程,其中全局性转录调控因子发挥着至关重要的作用。当面临不同环境胁迫情况时,丝状真菌通过启动全局性转录调控因子对菌体生长、繁殖及相关主代谢途径和次级代谢进行适应性转录调控,从而影响不同的次级代谢产物合成和分泌。针对已发现的丝状真菌不同类型全局性转录调控因子及其在提高菌体耐受性、调控菌体生长形态及次级代谢产物合成的研究现状展开论述,为丝状真菌在发酵生产过程中提高菌株耐受性和增加目的代谢产物等方面提供研究思路。

多元教育在专业课程《有机酸工艺学》教改中的探索

《有机酸工艺学》课程是生物工程和生物化工专业重点课程,其实践性极强。如何在课堂教学中,将学生已学习的基本知识和理论与生产实际相结合,是该课程实现教学目标的关键。本文通过应用多媒体教学、翻转课堂、实际案例分析等,提高学生发现、分析和解决问题的能力,进而实现对专业知识的综合运用和创新能力。为我国传统制造业的二次腾飞培养合格的技术人才。

过表达Spt7对黑曲霉生长及抗逆性影响

SAGA复合体是一种多功能蛋白复合物,负责细胞内10%以上的基因转录。Spt7作为SAGA复合体的核心蛋白,维持SAGA复合体的稳定。除酵母之外的真菌中并未有Spt7相关的研究报道。本研究对不同黑曲霉、丝衣霉等丝状真菌来源的Spt7的氨基酸序列进行多序列比对及蛋白结构的分析,发现Spt7在不同物种一致性较低,但均存在保守型的Bromo结构域。以黑曲霉1062为出发菌株,通过农杆菌转化法将过表达spt7的质粒转入1062菌株中,获得黑曲霉OE spt7转化子。通过对OE spt7转化子及对照组在CM培养基生长形态进行观察分析发现,过表达Spt7有益于菌体的生长及分生孢子的生成,在72 h时OE spt7转化子和对照组的菌落直径分别达到2.9 cm和2.8 cm,且转化子的孢子数量达到(5.8-6.3)×10^(7)/cm^(2),较对照组(2.3×10^(7)/cm^(2))提高1.5-1.7倍,且转化子菌丝分支较对照组多。另外,与对照组相比,OE spt7转化子在15 mmol/L H_(2)O_(2)条件下孢子萌发更快,菌落直径是对照组4倍,且在15%NaCl高渗以及39℃高温的条件下较对照组生长更加鲜活。通过qRT-PCR分析参与菌体抗氧化胁迫的过氧化物酶及耐高温的热休克蛋白基因的转录水平,发现除了CatR转录水平下调3.56倍,其他的过氧化物酶SOD、CpeB、GPX分别上调了3.8、1.89、3.56倍,除Hsp40及Hsp70较对照组无显著差异,Hsp90的转录水平上调19倍。

利用RNAi抑制cre1基因转录提高里氏木霉表达纤维素酶

本研究采用RNA干扰技术（RNAi）对里氏木霉主要的转录抑制因子cre1基因的表达进行抑制,以期提高里氏木霉生产纤维素酶的能力。通过PCR,从里氏木霉的基因组中扩增得到cbh1启动子、反向的cre1基因片段（568-963 bp）、正向的cre1基因片段（655-961 bp）和cbh2终止子,利用DNA assembler方法将这些基因连接到pRS424质粒上,构建成p Cre1-i质粒。再将RNAi盒分作两个片段扩增,同时转化里氏木霉并通过PCR鉴定阳性转化子。摇瓶发酵显示其中一株转化子在纤维素诱导培养基中培养4.5 d后,其纤维素酶的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和CBHI酶活为0.67、3.70和0.46 U/m L,较出发菌株分别提高了1.3、1.8和5.6倍。通过实时荧光RT-PCR检测,发现该转化子中cre1基因的转录水平比出发菌株降低了43%。

一株降解DON芽孢菌的筛选鉴定及其发酵饲料应用

研究旨在筛选高效降解呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)的菌株并将其应用在饲料发酵中。以苯基环氧乙烷为唯一碳源,筛选DON降解菌株,获得高效降解菌BL-14,结合形态学和分子生物学方法对该菌株进行鉴定,其16S rDNA与贝莱斯芽孢杆菌(Bacilus velezensis)相似度达99.43%。该菌在1μg/mL的DON浓度下摇瓶发酵16 h对DON降解率达82.63%,其在生长阶段可耐受DON。与筛选出的另外两株DON脱除率为28.50%和30.29%的乳酸菌(NJ8、RS1)协同发酵饲料原料,将饲料原料中污染的DON从3.81 mg/kg降到1.39 mg/kg,DON降解率达63.52%,并产生乳酸35 g/L。在饲料中添加贝莱斯芽孢杆菌BL-14和乳酸菌NJ8、RS1可以有效地去除其中的呕吐毒素,同时将其发酵成适口性好、营养丰富的发酵饲料。

米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型遗传转化体系的构建

米曲霉对潮霉素等多种抗生素不敏感,对其基因改造有一定困难。该研究以米曲霉3.042为出发菌株,建立pyrG筛选标记遗传转化体系。首先,分别运用紫外诱变法和左右臂同源重组法破坏米曲霉自身的pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培养基平板进行筛选,最终两种方法分别获得性状稳定的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变株米曲霉O11和米曲霉g-1。随后以缺陷型突变株为出发菌株,利用农杆菌转化法转入包含pyrG回补标记的质粒,其中米曲霉g-1突变株获得原养型的回补菌株,紫外诱变法获得的缺陷型突变菌株米曲霉O11未能恢复为原养型。研究表明米曲霉3.042 pyrG基因大片段缺失的缺陷型菌株,可直接以自身pyrG基因作为选择标记进行遗传改造。

一株高产β-苯乙醇酵母的筛选、鉴定及其增殖培养条件优化

为获得可高产β-苯乙醇的菌株,以β-苯乙醇作为筛选压力进行酵母菌筛选。成功获得一株可耐受4 g/Lβ-苯乙醇浓度的酵母菌YDF-1,可产2.83 g/Lβ-苯乙醇。通过形态学特征和18S rDNA分析鉴定,YDF-1为库德里阿兹威毕赤酵母。并通过单因素和响应面试验优化YDF-1增殖条件,最终优化培养基为葡萄糖100 g/L、胰蛋白胨3 g/L、KH2PO44 g/L、MgSO4·5H2O 0.5 g/L、CuSO40.25 g/L、MnCl20.142 g/L。在以接种量4%,转速250 r/min,30℃的条件下培养20 h,YDF-1可增殖到1.39×109 CFU/mL,相比未优化培养基增加了2.6倍以上。并以此为基础进行酵母增殖转化生产β-苯乙醇,48 h发酵液中β-苯乙醇含量可达到3.27 g/L。

敲除msn2对米曲霉生长和发酵产曲酸的影响

Msn2作为C2H2型锌指结构转录激活因子,参与调控真菌生长速率、分生孢子发育及多种应激反应等生物学过程。本论文以产曲酸米曲霉3.042为出发菌株,构建pyrG营养缺陷型菌株,通过msn2基因的上下游序列为同源重组臂和回补pyrG基因为筛选标记,最终获得一株敲除msn2且回补pyrG基因的转化子g-5号菌株。较原始菌株米曲霉3.042相比,g-5菌株生长受到抑制且孢子生成量显著降低60%,在含10%及以上葡萄糖环境中不产孢,但可耐受30 mmol/L H_(2)O_(2)。g-5菌株摇瓶发酵曲酸产量达到21.55 g/L,较米曲霉3.042的11.86 g/L,提升了81%。经RT-qPCR分析,与米曲霉3.042相比,g-5菌株的msn2基因不表达;在发酵6 d时米曲霉调节曲酸合成相关基因kojR和LaeA基因表达量分别提高4.13倍和21倍;g-5菌株菌丝生长及产孢相关基因brlA与tps1表达量较3.042下调63倍和128倍,相反ageB基因表达量大幅上调59倍。

肉葡萄球菌表面展示脂肪酶全细胞固定化

为提高奇异变形杆菌脂肪酶在食品、医药等工业领域的利用率,该研究以纤维素结合域为锚定基础,将食品安全菌株肉葡萄球菌及其表面展示脂肪酶进行全细胞固定;利用纤维素结合域与纤维素基质的特异性结合以获得全细胞固定化脂肪酶;探究固定化的最适条件以及固定化后酶学性质。结果表明:在最适的固定化条件(温度16℃、转速100 r/min、时间6 h、pH8.0),全细胞脂肪酶的固定化率可达76%,连续使用10次以后酶活力仍然能够剩余60%左右,且与游离菌相比固定化后其酶的最适温度提高5℃,更能耐受高温。

柠檬酸工业生产菌黑曲霉TNA09基因敲除体系的构建

黑曲霉TNA09是高产柠檬酸的工业生产菌株,由于经过多次物理和化学诱变筛选,所以对其进行传统遗传改造非常困难。该试验成功构建黑曲霉TNA09原生质体转化方法,实现该工业菌株的基因工程操作。通过试验得出原生质体制备和再生的最佳条件:取CM斜面培养5 d的新鲜孢子约1×10^(8)个至100 mL马铃薯葡萄糖肉汤(potato dextrose broth,PDB)液体培养基,于37℃、180 r/min摇床培养17 h,取幼嫩菌丝0.70 g至1.50%裂解酶+0.50%蜗牛酶+0.20%溶菌酶的复合酶体系中,37℃处理3.25 h,该条件下原生质体再生率可达36%,并利用聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)-CaCl_(2)介导的原生质体转化方法一次成功将黑曲霉laeA、cexA基因敲除,为后续的柠檬酸工业菌株的分子改造奠定了坚实基础。

“课后作业前置法”在生物工程科技英语课程中的应用探析

生物工程科技英语是将生物工程和生物化工与大学英语教学紧密结合的一门课程,是生物工程与生物化工专业学生深入探索本专业领域的一个专用语言工具。为进一步加强师生互动,提高本课程的教学水平,在长期教学的基础上,本文首次对提出了"课后作业前置"教学法,并对其在本课程中的教学改革应用进行了探析。

敲除Spt7对黑曲霉生长及菌落形态的影响

在酵母中Spt7作为一种多功能蛋白复合物Spt-Ada-Gcn5-乙酰转移酶(Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase,SAGA)复合体的核心蛋白,其不仅负责维持SAGA复合物的稳定,还负责细胞内10%以上的基因转录。除此之外,丝状真菌中关于Spt7功能的研究很少。【目的】探究Spt7在黑曲霉Aspergillus niger CGMCC 1062中的功能。【方法】以黑曲霉A.niger CGMCC 1062为出发菌株,通过农杆菌转化法将敲除spt7基因的质粒转入黑曲霉中;并分别将Δspt7菌株与对照组点种在CM培养基、不同碳源及含H2O2培养基上进行生长观察;通过实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析糖酵解关键基因、产孢相关基因的相对转录水平。【结果】成功获得spt7基因敲除菌株Δspt7;通过实验发现Δspt7菌株较对照菌株生长缓慢、菌落变白且产孢延迟;spt7基因的敲除显著影响菌株对不同碳源的利用;但Δspt7菌株同对照组均能在20 mmol/L H2O2的平板上正常生长。Δspt7菌株中糖酵解关键酶fbp、pfk、trk、pks、fda和gsdA基因的转录水平较对照组分别下调了2.65、4.46、6.05、4.90、3.20和3.20倍;产孢相关基因wetA、abaA和brlA的转录水平相较于对照组分别下调了529.93、172.40倍和9.61倍。【结论】spt7基因的缺失影响菌株的正常生长、菌落形态及分生孢子产生。

黑曲霉葡萄糖氧化酶在里氏木霉中的分泌表达及其对内源纤维素酶表达的影响

目前饲料工业中所使用的纤维素酶和葡萄糖氧化酶来自不同的表达系统,其生产成本较高;而在同一种微生物宿主中同时表达这两种重要的饲料工业用酶则有可能会降低成本。根据里氏木霉中密码子的偏好性优化黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因god,并利用DNA assembler方法构建pRS424-cbh1P-god-cbh1T质粒(p PGT质粒);通过PEG介导的原生质体转化法,将其转入里氏木霉Tu-6Δtku70尿嘧啶缺陷型菌株中,经筛选得到葡萄糖氧化酶酶活较高的一株转化子(2号),SDS-PAGE分析显示重组GOD的蛋白分子量大小约为70 k Da,进一步使用质谱确证了GOD得到成功表达。摇瓶发酵表明,2号转化子在微晶纤维素诱导92 h后,GOD酶活达到4.63 U/m L。该转化子的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和外切纤维素酶活分别为7.88 U/m L、2.58U/m L和0.84 U/m L,而出发菌株分别为6.79 U/m L、3.19 U/m L和0.57 U/m L,而β-葡萄糖苷酶由原来的0.66U/m L提高到1.65 U/m L(1.5倍)。实验表明,在里氏木霉中表达GOD能显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活,也能使总体纤维素酶活得到提高。