鹅副粘病毒HN基因在昆虫杆状系统表达及其抗原性鉴定

血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)是鹅副粘病毒诱导体液免疫的重要靶抗原。经pMD18-T-HN阳性质粒扩增了HN基因,亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,并将其与线性化的杆状病毒共转染对数生长期的sf 9细胞,得到重组杆状病毒rBv-HN,试验表明,HN在昆虫细胞中得到表达,且产物具有抗原性。

鹅副黏病毒NP蛋白间接ELISA检测方法的建立及免疫鹅抗体水平的检测

以纯化的鹅副黏病毒NP蛋白为包被抗原,建立了检测鹅副黏病毒NP蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶200,兔抗鹅IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶2 000,抗原和血清、血清和二抗均于37℃反应1 h,底物于37℃显色15 min。此间接ELISA方法的特异性强、重复性好。应用该方法对试验鹅血清进行检测,以HI试验为参照。经统计学处理后,比较了两方法测得的抗体效价,分别建立了各组鹅群的回归方程。显著性检验证明,这两种方法检测的抗体效价呈显著相关关系。

鹅细小病毒VP3基因和鹅副黏病毒F基因在重组禽痘病毒中联合表达

将重组转移载体质粒pSY681-VP3-F-LacZ与脂质体转染禽痘病毒感染的CEF细胞,通过五轮蓝斑筛选,获得纯化的重组病毒rFPV-VP3-F。经PCR检测,表明GPV-VP3基因和GPMV-F基因已重组到特异性禽痘病毒基因组中;Dot-ELISA和间接免疫荧光试验,证明VP3蛋白和F蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得有效表达并且两种蛋白都保持其反应原性。

鸭甲肝病毒VP1基因克隆及序列分析

通过PCR技术,从自行分离的鸭甲肝病毒JS株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段,并对该片段进行序列测定及分析。结果显示JS-VP1与DHAV-A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在62.0%-64.4%之间,与DHAV-B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在63.6%-63.8%之间,与DHAV-C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92.3%-98.5%之间,分析表明JS株为鸭甲肝病毒基因C型,血清型分型为韩国新型。进化树表明JS株与SD02株的亲缘关系较进,进一步说明VP1基因的核苷酸序列是DHAV基因组中的高度可变区,可作为DHAV基因型研究的标记,分离毒株为DHAV的防治及疫苗的设计奠定了基础。

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护相关性研究

以实验室试制的3批猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(JL株+HN-1株),对3~5日龄仔猪进行接种,免疫后14、21 d分别采血,分离血清,检测各组仔猪的TGEV、PEDV中和抗体,并以TGEV和PEDV强毒进行攻毒。结果表明,中和抗体效价的升高,对仔猪的保护率也随之升高,两者呈正相关。当血清中TGEV中和抗体达到132时,可以完全保护仔猪抵抗TGEV强毒的攻击;PEDV中和抗体达到116时,可以完全保护仔猪抵抗PEDV强毒的攻击。

小鹅瘟病毒卵黄抗体被动免疫期研究

本实验取3批实验室试制的卵黄抗体,琼扩效价为1∶16,按0.5 m L/只接种1、3日龄易感雏鹅,分别在注射抗体后1、3、5和7日攻毒,观察攻毒保护情况。结果显示:1日龄雏鹅注射抗体后1日攻毒保护率为96.67%,3日攻毒保护率为100%,5日攻毒保护率为86.67%,7日攻毒保护率为76.67%;3日龄雏鹅注射抗体后1日攻毒保护率为100%,3日攻毒保护率为96.67%,5日攻毒保护率为86.67%,7日攻毒保护率为80%。以免疫攻毒保护率不低于80%为标准,本研究确定小鹅瘟病毒卵黄抗体的被动免疫保护期为5日,随着时间的延长,保护作用逐渐减弱。

小鹅瘟卵黄抗体效价与攻毒保护相关性试验

将实验室试制的3批小鹅瘟卵黄抗体,琼扩效价为1:16,分别稀释成琼扩效价为1:4、1:8,分别按每只0.5 m L接种3日龄易感雏鹅,24 h后,试验组与对照组攻击小鹅瘟病毒。结果显示:雏鹅注射相同剂量不同琼扩效价的卵黄抗体,随着卵黄抗体琼扩效价的升高,对雏鹅的保护率也随之升高。

传染性法氏囊病病毒感染鸡脾脏病理变化的研究

传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染鸡的临床诊断主要检测法氏囊组织的病理变化,包括分析感染组和对照组的法氏囊重量与体重比值(囊重指数)。本研究采用IBDV强毒株BC6-85感染22日龄SPF鸡3 d后,对其免疫器官法氏囊、脾脏及胸腺的重量和组织病理变化等进行检测。研究显示,与健康对照组相比,感染组的法氏囊虽然呈现明显病理变化,但平均囊重指数无显著减少。此外,鸡感染IBDV后脾脏也发生了明显的外观和组织学病理变化,特别是其重量与体重的比值增加极其显著(p<0.01),并且感染组内各样本的脾脏重量与对应体重显著相关(r=0.695,p=0.026)。IBDV感染鸡的胸腺未发现明显病理改变。以上虽然仅为IBDV特定病毒株的结果,且样本数量有限,但提示作为重要的B淋巴细胞和单核/巨噬细胞器官,脾脏在IBDV感染鸡的重量与体重比,(脾重指数,本研究为1.66)可以考虑成为临床和现地快速诊断法氏囊病的参考指标之一。

小鹅瘟病毒卵黄抗体田间试验

在完成小鹅瘟病毒卵黄抗体实验室研究的基础上,于2015年中间试制5批卵黄抗体,经检验合格后,分别在3个鹅场,总计21 600只雏鹅进行了田间试验。结果表明,在实验观察期内,未发生小鹅瘟病毒感染,且无任何不良方应,3个鹅场的免疫组在生产性能方面与非免疫雏鹅均无显著差异;免疫攻毒组雏鹅攻毒保护率为98%。证明研制的小鹅瘟病毒卵黄抗体安全、有效。

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗田间试验

猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）是引起猪腹泻的重要病原,主要引起两周龄以内仔猪发生以急性腹泻、脱水及高死亡率为特征的猪传染性胃肠炎（TGE）,该病给世界各国养猪业造成了巨大经济损失。我国从20世纪50年代起就有猪传染性胃肠炎的报道,并且一直以来在我国养猪场时有发生,

产蛋鸡免疫程序对卵黄抗体效价的影响

试验用小鹅瘟免疫原按8种免疫程序接种120日龄产蛋鸡,分别在接种后不同时间琼脂扩散试验试验检测卵黄抗体效价,筛选出最佳免疫接种程序。基础免疫,产蛋鸡每只肌肉注射小鹅瘟活疫苗1.0 m L(5羽份);在基础免疫后14 d进行第2次接种,加强免疫,产蛋鸡每只肌肉多点注射小鹅瘟灭活疫苗2.0 m L;在加强免疫后14 d进行第3次接种,强化免疫,产蛋鸡每只肌肉多点注射小鹅瘟灭活疫苗3.0 m L。

小鹅瘟卵黄抗体的理化特性研究

对实验室试制的3批小鹅瘟卵黄抗体（lg Y）进行了理化性质测定。结果表明,电泳出现2条电泳带（67 k D和22 k D左右）,证明提取的Ig Y纯度较高;Ig Y在2.0 mg/m L的胃蛋白酶以及2.5 mg/m L的胰蛋白酶环境下,37℃作用3h,其抗体效价均无明显下降;Ig Y在60℃作用30min,其抗体效价也无明显下降;在p H4-11时稳定;反复冻融5次,抗体效价稳定。该研究为小鹅瘟卵黄抗体的使用奠定基础。

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)抗体产生期和免疫持续期试验

以实验室制备的3批制品各经颈部皮下接种7日龄和21日龄SPF鸡,7日龄鸡于免疫后7、11、14、21、28d及1、2和3个月;21日龄鸡于免疫后7、11、14、21、28d及1、2、3、4和5个月时采血,分离血清,分别测定免疫鸡血清中鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)病毒和禽腺病毒抗体效价。试验结果表明,实验室3批制品免疫7日龄SPF鸡后,免疫后11d鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)产生抗体,21~28d时3种病毒抗体均达到抗体高峰,高峰期持续至免疫后1个月,免疫后3个月下降到有效保护标准以下。三联疫苗免疫21日龄SPF鸡,免疫后11d鸡新城疫病毒、禽流感(H9亚型)产生抗体,针对3种病毒的抗体在免疫后21~28d达到抗体高峰,高峰期持续至免疫后2个月,免疫后3个月开始下降,免疫后5个月下降到有效保护标准以下。因此,鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)免疫<2周龄的鸡免疫持续期为2个月,免疫>2周龄的鸡免疫持续期为4个月。

鸭病毒性肝炎二价(1型+3型)卵黄抗体(JS株+SD株)被动免疫持续期研究

本实验取3批实验室试制的卵黄抗体,按0.5 mL/只接种3日龄SPF雏鸭,1.0 mL/只接种6日龄SPF雏鸭,分别在注射抗体后1、3、5和7 d攻毒,观察攻毒保护情况。结果显示,3和6日龄雏鸭接种抗体后1~5 d注射1型和3型鸭甲型肝炎强毒,攻毒保护率均在90%以上;雏鸭接种抗体后7 d注射鸭甲型肝炎强毒的攻毒保护率仅在70%~76.7%之间,攻毒对照组90%~100%死亡,健康对照组100%健活。说明注射抗体后5 d抗体仍能产生良好地保护作用,而7 d后保护作用大幅减弱。因此,确定鸭病毒性肝炎二价（1型＋3型）卵黄抗体（JS株＋SD株）被动免疫保护期为5 d。

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)抗体效价与鸡攻毒保护相关性试验

实验室制备的三联灭活疫苗分别以不同免疫剂量免疫接种21日龄SPF鸡,免疫后21日,分别采血测定血清抗体效价,并根据抗体效价重新分组,进行攻毒保护试验。试验结果表明,三联灭活疫苗各组分抗体效价与攻毒保护均呈正相关,疫苗各组分抗体效价可代替动物效检试验。根据试验结果及我国兽药标准,将三联灭活疫苗血清标准确定为:新城疫病毒HI抗体效价的几何平均值应≥1:16;禽流感(H9亚型)病毒HI抗体效价的几何平均值应≥1:128;Ⅰ群4型禽腺病毒抗体效价应≥1:1。

鸭肝炎病毒Ⅰ型、新型二价精制卵黄抗体在SPF雏鸭体内的代谢规律研究

采用实验室试制的二价抗体接种5日龄SPF雏鸭,分别在注射抗体后24、48、72、96、120、144和168 h进行采血及分离血清。采用鸭胚中和试验,进行Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒抗体效价的测定。结果表明,抗体注射24~72 h,血清中Ⅰ型和新型鸭肝炎病毒抗体效价基本稳定在峰值,从96 h开始缓慢下降但仍在保护效价（1：32）以上,至144 h抗体下降至保护效价以下,即抗体的被动保护期在5 d以内。

卵黄抗体中外源病毒的不同灭活方法比较

为确保提取卵黄抗体的安全性,比较了甲醛和二乙烯亚胺对卵黄抗体中外源病毒的灭活效果。在卵黄抗体中,人工混入鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9型)、禽传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒和禽脑脊髓炎病毒,分别加入终浓度为0.02%二乙烯亚胺以及0.03%、0.05%和0.08%的甲醛,25℃放置24 h。结果显示,0.02%二乙烯亚胺和0.03%甲醛只能灭活部分病毒,而0.05%和0.08%甲醛能完全灭活上述病毒并且不降低抗体活性。试验表明,可使用0.05%甲醛灭活卵黄抗体中潜在病毒。

鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La?Sota株+TJ株+HY株)经皮下和肌肉接种鸡的效力试验

以实验室试制的3批鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)经皮下和肌肉注射14和21日龄SPF鸡.免疫后21日,分别接种鸡新城疫、H9亚型禽流感和I群4型禽腺病毒强毒.结果表明,经肌肉和颈部皮下注射疫苗的14和21日龄鸡的攻毒保护率均为100%,攻毒对照组鸡100%死亡、发病或感染,健康对照组均100%健活或未感染.试验证明,鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)经皮下及肌肉途径注射鸡均能起到良好的预防效果,因此,确定疫苗的注射途径为肌肉或颈部皮下.

鸡传染性法氏囊病特点、诊断及国内外灭活疫苗免疫效力比较

鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起仔鸡的一种急性、高度接触性传染病。目前疫苗接种是预防该病的主要方法,现使用的疫苗主要为灭活疫苗。为了比较进口与国产鸡传染性法氏囊病灭活疫苗的免疫效力,对市场上某公司国产鸡新城疫—传染性法氏囊病二联灭活疫苗与进口的鸡新城疫—传染性支气管炎—传染性法氏囊病三联灭活疫苗进行免疫效力比较试验。结果表明,二者在免疫抗体水平和攻毒保护的结果没有明显差异,只有在注射剂量上进口疫苗比国产疫苗使用的剂量少。