数据驱动的人体正常和癌症组织中糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-AP)相关基因表达谱的综合分析

人体细胞中含有超过146种GPI锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored protein,GPI-AP),包括受体、配体、粘附分子和酶等。这些蛋白通过GPI锚定在细胞膜表面的脂筏中,发挥多种重要生物学功能。目前,已经对GPI锚定蛋白的生物合成开展了大量研究,其中GPI-AP的生物合成包括至少20步反应,已鉴定出超过40个GPI-AP合成相关基因,但是仍缺乏对于GPI-AP相关基因在正常组织与癌症组织中表达调控的研究。本研究利用来自于TCGA数据库和GTEx portal的基因表达数据,同时结合使用GlycoMaple糖基化通路分析工具,对正常组织与癌症组织中参与GPI-AP合成和编码GPI-AP的基因的表达情况进行了全面分析。研究发现,与正常组织相比,在早期胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、胰腺癌、睾丸生殖细胞癌、原发性皮肤黑色素瘤和转移性皮肤黑色素瘤中,参与GPI-AP合成的基因表达发生了显著变化,其中PIGY在这6种癌症中表达量均有上升。此外,GPI锚定蛋白编码基因CD14在这6种癌症中的表达量上升。GPI锚定蛋白编码基因GAS1、GPC2、GPC4仅在早期胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤中表达量上升,说明部分GPI锚定蛋白如GAS1等可以作为早期胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤生物标志物。本研究为GPI-AP相关基因在正常组织与癌症组织中的表达情况提供了新的见解,为GPI-AP作为生物标志物的开发打下了坚实基础。

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。

HEK 293细胞中重组型抗体表达和分泌的监测系统的构建

免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)作为一种十分重要的生物药物,已被广泛应用于多种医学诊断和治疗。为构建高效表达重组抗体的哺乳动物生产菌株,运用可以灵活检测抗体分泌运输的表达细胞株,从而充分理解抗体的折叠、转运及分泌尤为重要。作者在哺乳动物细胞株(HEK 293)中构建了一个稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)融合型抗体E-F-HyHEL10的表达系统,可通过流式细胞术检测抗体的分泌运输。此哺乳动物细胞表达系统具有良好的抗体表达和分泌水平,且稳定维持了抗体的功能活性。使用布雷菲德菌素A(brefeldin A)和放线菌酮处理细胞后,来自胞内E-F-HyHEL10的GFP荧光信号与抗体分泌水平呈正相关。结果表明,本研究中构建的抗体表达系统可实现抗体表达、累积和分泌水平的灵活准确监测,未来可应用于哺乳动物细胞中抗体分泌相关因子的筛选。

酿酒酵母中PiggyBac转座子筛选系统的构建

PiggyBac(PB)是来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的TTAA型转座子。PB转座子系统可作为一种插入型突变工具,应用于多种真核细胞中。本研究在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中构建了一个基于PB转座子的筛选系统。系统由插入ADE2基因编码框的PB转座子及由半乳糖启动子调控表达的PB转座酶(PBase)两部分组成。在PBase诱导下,PB转座子可以从原始位点无痕移除并随机插入新的基因位点。PB转座子在转座过程中保持单一拷贝数,在每个突变细胞中只有一个插入位点,并可快速检测突变基因。实验结果表明:所构建的PB转座子筛选系统可应用于酿酒酵母中的基因筛选。

筛选特异性抑制酿酒酵母产孢的人类基因

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)二倍体细胞在缺乏氮源且存在非发酵型碳源时,营养细胞停止生长,进入产孢过程并通过减数分裂形成单倍体孢子。产孢过程并不存在于哺乳动物细胞中,但该过程中发生的很多细胞活动在真核细胞中存在保守性。作者建立了一个筛选特异性抑制酿酒酵母产孢的人类基因的方法。在酿酒酵母中表达单独的人类基因,筛选得到抑制产孢过程但对酿酒酵母营养细胞生长不产生影响的候选人类基因。获得的候选基因很大可能涉及营养敏感性、减数分裂以及膜运输重组这些产孢过程中发生的细胞活动。本研究对新功能人类基因的发现以及将酿酒酵母作为遗传研究工具有着重要的意义。

Dfg5在酿酒酵母细胞壁合成中的功能分析

酿酒酵母中合成的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)一半停留在细胞膜上,另一半被转运至细胞壁的β-1,6-葡聚糖上形成GPI锚定细胞壁蛋白(CWPs)。有分析指出,Dfg5和Dcw1是定位于细胞膜的GPI锚定蛋白,可能以同工酶的形式参与GPI-APs转运。但这两个同源蛋白的分子作用机制尚不清楚。为探究Dfg5的作用机制,本研究构建了dfg5?驻PMET3DCW1条件突变菌株。研究发现在DCW1表达抑制型突变株中Cwp1在细胞膜上大量积累。对Dfg5中与甘露糖苷酶催化活性相关保守氨基酸位点分别定点突变,产生的突变蛋白Dfg5W71A、Dfg5D122A、Dfg5D123A无法回补条件突变株的生长缺陷。然而截断Dfg5前导肽的分泌型Dfg5则可回补条件突变株的生长缺陷。上述结果可推测在GPI-APs锚定至细胞壁中,Dfg5至少具有糖苷酶,可将Cwps从细胞膜上的GPI锚中释放出来。

基于细胞融合开发双基因共敲除技术

基因编码工具(例如CRISPR/Cas9)的出现使敲除哺乳动物细胞基因成为现实。然而,实现细胞的多基因敲除成功率低且所需时间长。细胞融合技术是构建杂合细胞的常用方法,通过融合两种不同表型的细胞,构建出一种具有杂合表型的新型细胞。但是,由于基因的互补作用,通过基因敲除而获得的性状在细胞融合后成为隐性性状,融合细胞不能表现该性状。本研究的目的是设计一种通过细胞融合技术和CRISPR/Cas9技术获得基因双敲除细胞的方法。由于现阶段没有关于HEK 293细胞株细胞融合的参考数据,所以首先在HEK 293野生型细胞株中分别敲除GPI生物合成必需的PIGA或PIGK,获得PIGA-KO细胞株和PIGK-KO细胞株,并以这两个细胞株作为模型进行条件优化。经过反应条件优化,HEK 293细胞的融合效率显著提高,且实现了FUT8敲除细胞株和ST6GAL1敲除细胞株的快速融合;其次是将细胞融合技术与CRISPR/Cas9技术结合从而实现多种糖基因的快速敲除。将分别含有FUT8和ST6GAL1目标导向RNAs且都能稳定表达Cas9蛋白的两个细胞株进行融合,即可获得FUT8和ST6GAL1基因都被敲除的双敲细胞株。实验结果表明,将细胞融合技术和CRISPR/Cas9技术结合可简便而快速地获得基因双敲除细胞株。

哺乳动物细胞中糖链结构的改造

由于蛋白质需要正确的折叠和糖基化修饰,目前生物药用蛋白质主要通过哺乳动物细胞生产。然而利用哺乳动物细胞生产医药蛋白质也面临着高成本、糖链不均一等问题。本研究中,我们构建了敲除高尔基体α-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ的HEK293细胞株,其中MAN1A1和MAN1A2双敲除细胞株D-KO35中蛋白质上高甘露糖型N-比例增加。在这株双敲细胞中,溶酶体膜蛋白LAMP2上的糖链对糖链内切酶-H处理敏感,证明蛋白上N-糖链结构以高甘露糖型结构为主。研究结果表明,在哺乳动物细胞中敲除高尔基体α-1,2-甘露糖苷酶的细胞株,可用于生产均一化N-糖链结构的重组糖蛋白。

利用PiggyBac转座子系统快速控制GPI锚定蛋白的表达

GPI锚定蛋白的合成是一个发生在内质网中多步骤、多基因参与的过程。PIGK是GPI锚定蛋白转酰胺酶复合物的一个催化亚基,负责把GPI前体转移到蛋白质上。作者在人体胚胎肾细胞(HEK 293)中获得了PIGK敲除的细胞株,敲除PIGK的细胞不能表达GPI锚定蛋白。利用piggyBac(PB)转座子系统,在细胞中重新插入PIGK基因,细胞膜表面的GPI锚定蛋白恢复表达。实验成功构建了HEK293pB-PIGK细胞株并命名为G36,通过引入PB转座酶或FLP重组酶,可以控制GPI锚定蛋白的表达。本系统可以快速调控细胞表面蛋白质的表达并能够用于基础研究和工业应用。

GPI锚定蛋白前体C-端附着信号的疏水性决定其内质网相关蛋白质降解途径

目前,已知超过150种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol anchored protein,GPI-anchored protein)在哺乳动物细胞中表达,并参与免疫识别、细胞通讯与信号转导等多种生理过程。当蛋白质无法被GPI修饰时,前体蛋白质通过内质网相关蛋白质降解(endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD)途径降解。然而,GPI锚定蛋白ERAD的降解机制尚不清楚。为了探究GPI锚定蛋白前体的ERAD途径的具体机制,本研究敲除人胚胎肾细胞293细胞株(HEK293)的GPI转酰胺酶复合物亚基PIGS基因,进而敲除E3泛素连接酶HRD1和GP78基因,之后随机在PIGS-KO,PIGS-HRD1-KO和PIGS-GP78-KO过表达16种GPI锚定蛋白质(以亲本PIGS-KO细胞株作为对照组),Western印迹结果证明,GPI锚定蛋白前体在细胞株PIGS-HRD1-KO中的蛋白质积累量(I_(PHK))和PIGS-GP78-KO中的蛋白质积累量(I_(PGK))体现出明显的差异性,例如LYPD2的I_(PHK)是I_(PGK)的28倍,NEGR1的I_(PHK)是I_(PGK)的0.12倍,这说明GPI锚定蛋白前体的降解主要依赖于2种ERAD途径:ERAD-L和ERAD-M。且HRD1与GP78的2种E3泛素连接酶被选择性地用于GPI锚定蛋白前体的降解。朊病毒(prion)和CD59嵌合构建体表明,GPI前体蛋白C-端GPI附着信号决定了降解途径(朊病毒I_(PHK)/I_(PGK)由突变前的0.33改变为突变后的23.42。相反的是,突变前CD59的I_(PHK)/I_(PGK)是11.45,突变后变为2.81)。接着,通过对C-端附着信号疏水性的计算,我们发现,这种选择性差异由前体蛋白质C-端GPI附着信号疏水性的不同造成。本研究初步解释了未被GPI锚修饰的GPI锚定蛋白前体在ERAD中的降解机制。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组枯草芽孢杆菌构建及固定化应用

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase)是异构化D-果糖生成D-阿洛酮糖(D-allulose)的关键酶。为提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性并获得可重复使用的D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组枯草芽孢杆菌固定化细胞,N端融合双亲短肽,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,异源D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中正确折叠,蛋白大小为33 kDa。40℃孵育48 h,SAP1-DSDPEase残余酶活仍保持在58%。固定化细胞最优条件为海藻酸钠浓度2%、二氧化钛添加量1︰4(二氧化钛︰海藻酸钠)、氯化钙溶液浓度2%、戊二醛0.02%作为交联剂。该条件下固定化细胞酶活回收率高达82%,固定化细胞与游离细胞相比,最适反应温度不变均为80℃,热稳定性提高,连续10次操作使用,酶活回收率仍保留58%,机械强度仍保持100%,转化率仍保持在28.8%,残余酶活保持在70.5%。在海藻酸钠溶液中加入二氧化钛可减少固定化细胞的细胞泄露,增大了机械强度。

XRE家族转录因子XrpA调控粘质沙雷氏菌的耐酸能力

【背景】工业菌株的耐酸能力是发酵过程中的一大挑战。粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)作为肠杆菌科的一种细菌,可生成2,3-丁二醇、乙偶姻和灵菌红素等高附加值产品。然而目前对于粘质沙雷氏菌酸耐受能力的分子机制尚不清楚。【目的】通过对转录调控因子XrpA的挖掘以及对其功能的研究,探究粘质沙雷氏菌酸耐受能力的分子机制,为改善工业菌株耐酸能力提供新的策略。【方法】通过对粘质沙雷氏菌进行转座子插入突变,构建了一个Tn5G转座子插入突变文库,利用文库筛选了一株酸敏感型突变株,并对其进行测序鉴定;同时还对突变菌株中与耐酸相关关键基因的转录水平以及细胞膜通透性、细胞膜完整性和H+-ATPase的活性变化进行检测。【结果】发现了一个响应酸胁迫的转录调控因子BVG90_23400,其属于XRE超级家族转录调控因子,命名为XrpA。在酸性条件下,与野生型菌株(JNB5-1)相比,xrpA被阻断后导致了粘质沙雷氏菌多种表型的变化,其中包括生物量显著下降、H+-ATPase活性降低、细胞膜的通透性以及完整性受到破坏。【结论】XrpA影响粘质沙雷氏菌耐酸能力的分子机制是通过对细胞膜通透性、细胞膜完整性以及H+-ATPase活性的正向调节来维持细胞在酸性条件下的内环境稳态。同时,XrpA可以通过调节酸性应激反应基因的转录水平来影响细胞内环境稳态,从而调控粘质沙雷氏菌对低pH的耐受能力。

酵母Dop1及其同源蛋白DOPEY对细胞糖基化和囊泡运输影响的研究

蛋白质糖基化是一种保守的翻译后修饰,对多种细胞现象至关重要。在酵母或动物细胞高尔基体中的糖链处理由结构相似的糖基转移酶或糖苷酶催化。囊泡运输等多种因素会影响糖基转移酶在高尔基体中的稳态定位,进而影响糖基化。该研究探讨高尔基外周蛋白Dop1对细胞糖基化和囊泡运输的影响。共聚焦荧光显微镜活细胞成像显示,Dop1主要定位于晚期高尔基体。Dop1及其相互作用蛋白Neo1(P4 ATPase)均参与高尔基体后期的囊泡运输。此外,Dop1介导糖基转移酶Och1的逆向运输而影响糖基化。进一步,哺乳动物DOPEY1和DOPEY2是酵母Dop1的同源蛋白。DOPEY1或DOPEY2的缺失导致高尔基体结构的改变,轻微地影响细胞糖基化。综上,酵母Dop1和哺乳动物DOPEY都参与了细胞后期的蛋白质囊泡运输,并影响高尔基体形态或糖基化。