超高压脱细胞技术制备组织工程带瓣血管支架

背景：研究表明同种瓣膜移植术后发生的退行性变性与其留存的细胞成分激发宿主免疫反应有显著的相关性。目的：采用超高压结合核酸酶洗涤方法处理猪带瓣膜血管。观察瓣膜脱细胞的效果及猪内源性反转录病毒的去除情况。设计、时间及地点：对比观察实验。于2004-04／2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成。材料：实验选用月龄1-3个月的健康雄性迷你猪幼猪，体质量3-5kg。方法：无菌条件下取出猪带瓣肺动脉血管。分为3组：对照组：无任何处理。表面活性剂组：将带瓣管道用Triton X-100溶液浸渍、搅拌24h后洗净。超高压处理组：用超高压设备以981MPa超高静水压（4℃）将供体来源细胞压碎。结合核酸酶的消化作用，磷酸盐缓冲液的搅拌洗涤，脱去细胞残片形成带瓣膜血管支架。主要观察指标：光镜下观察支架形态结构，透射电镜下观察支架细胞成分去除和支架纤维保留情况。扫描电镜观察支架表面的超微结构。观察两种方法处理瓣膜的弹性率差异。检测猪内源性反转录病毒前病毒DNA。定量检测超高压脱细胞前后带瓣管道中DNA含量的变化。结果：①超高压处理组瓣叶及瓣根组织表面及内部细胞完全消失。保留了细胞外基质，DNA含量显著降低。表面活性剂组瓣根组织深部的细胞无法渗透、除去。②超高压处理组瓣膜弹性率几乎不变。瓣膜功能保持较好。表面活性剂组瓣膜弹性率增加。③超高压处理组猪内源性反转录病毒被成功灭活，无法测出。表面活性剂组无法将猪内源性反转录病毒灭活。结论：采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分，可将内源性反转录病毒成功灭活。保持了细胞外基质结构和功能的完整性，脱细胞效果优于表面活性剂方法。

超高压脱细胞方法制备组织工程血管支架(英文)

背景：构建组织工程血管支架的研究多集中于生物可降解支架和脱细胞同种或异种血管支架方面,但存在急需解决的若干问题：如生物可降解支架生物降解速度的控制以及植入脱细胞天然血管支架可能带来供体来源病毒细菌感染受体问题等。目的：采用超高压结合核酸酶洗涤方法（超高压脱细胞技术）处理同种异体血管,观察该方法的脱细胞效果以及猪内源性反转录病毒的去除情况。设计：对比观察实验。单位：日本国立心血管病中心研究所。材料：实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成。选用健康雄性迷你猪幼猪,由日本九州鹿儿岛JapanFarm食用猪养殖场提供,体质量3～5kg,猪龄1～3个月。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。实验涉及的主要试剂和仪器：Hoechst33258为日本同仁化学研究所产品;超高压设备KOBELCO为神户制钢所产品;PCR为GENEAMPPCRSYSTEM9700产品。方法：实验于2004-04/2005-04在日本国立心血管病中心研究所完成。无菌条件下取出猪降主动脉血管,用超高压设备以981MPa超高静水压（4℃）将供体来源细胞压碎,结合核酸酶的消化作用,PBS的搅拌洗涤,脱去细胞残片形成血管生物支架。主要观察指标：①利用Hoechst33258荧光探针,定量检测超高压脱细胞血管中DNA含量;用JEMl00cx型透射电镜观察血管组织细胞成分去除和支架纤维保留情况;用JBM5200型扫描电镜观察支架的超微结构;100倍光镜下观察血管壁形态结构。即从组织学、分子生物学、免疫组组织化学水平评估超高压脱细胞方法的抗原去除效果。②用PCR方法检测幼猪脱细胞血管中的猪内源性反转录病毒（PERV）前病毒DNA,评估超高压脱细胞方法对以猪内源性反转录病毒为代表的病原微生物的杀灭效果。结果：①血管壁形态结构：血管壁纤维波浪状结构保存完好,组织内的细胞均被除去。②细胞去除效果：透射电镜见细胞成分均已消失。但保留有胶原纤维和弹性纤维。扫描电镜可见细胞已被完全脱去,只剩脱细胞支架。③病原微生物的杀灭效果：经过超高压处理,猪内源性反转录病毒被成功灭活,无法测出。而采用表面活性剂脱细胞组无法将猪内源性反转录病毒灭活。④DNA含量：超高压脱细胞处理前,血管中DNA含量为（31.7±3.5）mg/L;超高压脱细胞处理后,DNA含量为（1.16±0.23）mg/L,DNA含量显著降低（P〈0.01）,提示超高压脱细胞方法已将细胞核及内容物大部分除去。结论：实验证明采用超高压脱细胞方法可基本除去支架内细胞成分,可以将病源微生物杀灭（将猪内源性反转录病毒成功灭活）。

超高压脱细胞组织工程血管支架的实验研究

目的采用新的更安全的抗原去除技术-超高压脱细胞方法处理同种异体血管,观察该方法的脱细胞效果以及猪内源性逆转录病毒(PERV)的去除情况。方法无菌条件下取出猪降主动脉血管,用10 000atm超高静水压(4℃冷方压)将供体来源细胞压碎,结合酶的消化作用,PBS的搅拌洗涤,脱去细胞残片形成血管生物支架。对该支架脱细胞效果进行组织学评估、超微结构观察、检测DNA含量同时检测PERV。结果组织学显示超高压脱细胞方法可完全除去血管支架内的供体细胞成分,经超高压脱细胞处理后DNA含量显著降低(p<0．0001)、PERV被成功灭活。结论超高压脱细胞方法可为我们提供更安全可靠的组织工程血管支架。