RNA干扰细胞周期蛋白依赖激酶6基因对尤文肉瘤细胞生物学行为的影响

背景与目的:细胞周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,有实验报道其在尤文肉瘤细胞中呈高表达,但在尤文肉瘤细胞中的生物学功能及相关机理仍不十分清楚。本研究旨在通过研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默CDK6基因表达,探讨其对尤文肉瘤A673、SK-ES-1细胞生物学行为的影响。方法:将化学合成的CDK6-siRNA转染至A673及SK-ES-1细胞中,实时荧光定量PCR法检测转染前后细胞中CDK6 mRNA的表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测转染前后细胞CDK6以及CDK6下游因子视网膜母细胞瘤基因(Rb)、磷酸化Rb(P-Rb)的蛋白表达;分别采用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移以及侵袭能力的变化。结果:实时荧光定量PCR结果显示,CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6的表达(P<0.01)。抑制CDK6表达后细胞的增殖速度明显减缓,细胞周期分布发生改变,G0/G1期细胞的比例上升,而S期细胞的比例下降,细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.01)。各组细胞的迁移能力:untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(516.00±58.59)个、(534.00±124.77)个、(192.33±68.92)个,SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(371.33±29.67)个、(363.33±60.28)个、(200.00±20.00)个,差异有统计学意义(P<0.01);各组细胞的侵袭能力:untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(251.00±42.93)个、(238.67±78.62)个、(94.67±23.03)个,SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(310.00±35.36)个、(302.33±41.31)个、(105.00±54.08)个,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示,CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6以及下游因子P-Rb的表达(P<0.01),但细胞总Rb表达量无明显变化。结论:针对CDK6基因的特异性小RNA干扰片段能够下调CDK6基因及蛋白的表达,并抑制尤文肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移,诱导其凋亡。

Let-7a稳定转染尤文肉瘤细胞系的建立

目的:构建携带let-7a基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma,ES)细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。方法:通过Gateway克隆技术,扩增attB1-K-eGFP-let-7a-1-attB2片段,与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与母载体——pLV.Des2d.P/neo进行LR重组反应,生成目的质粒——pLV.Des2d.P/neo-EF1A>eGFP/let-7a;通过PCR及测序验证目的质粒;将携带let-7a的重组慢病毒质粒稳定转染ES细胞株A673和SK-ES-1获得A673/let-7a、SKES-1/let-7a细胞株;通过real-time PCR检测稳定转染细胞株内let-7a的表达水平,Western blot检测其靶基因CDK6的表达。结果:PCR证实获得的目的条带与理论值相符,测序分析证实携带let-7a的真核表达载体插入序列及位点正确;real-time PCR及Western blot检测结果显示,与转染空载质粒及未处理组的A673、SK-ES-1细胞株相比,稳定转染重组目的基因的A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a细胞高表达let-7a,分别达到8.5倍(P=0.000)和6.5倍(P=0.001),差异具有统计学意义;且细胞内let-7a靶基因CDK6的表达量明显减少。结论:成功构建稳定表达let-7a的ES细胞株A673/let-7a、SK-ES-1/let-7a。

仰焊背弧 短弧焊接法

本文介绍了仰焊背弧短弧焊接法的工艺与优点。采用此法可保证焊接质量,节约焊条,提高工效。

电焊钳的改进

本文针对电焊钳施焊时烫手问题,提出了三种改进电焊钳结构的方法。

加入WTO后景德镇陶瓷发展战略研究

伴随着改革开放的进一步深入与发展,景德镇的陶瓷产业格局也发生了新的变化,这些变化主要体现在三个方面.第一,由单一经营模式向多元化经营模式转变.第二,由规模化大生产向规模化生产与作坊式生产相并存,小而全占主要地位的格局转变.第三,由日用瓷、陈设瓷全面领先向陈设艺术瓷尚领先,日用瓷受到严峻挑战的格局转变.我国加入WTO后,陶瓷业将面临更加严峻的挑战,也将面临新的机遇.一方面,加入WTO后,陶瓷业将面临更加激烈的国际市场竞争和更多的竞争对手.而经营理念与管理水平的落后,劳动力素质偏低,技术含量偏低、组织结构不合理等因素,势必使入世后的景德镇陶瓷业面临更大的风险;另一方面,加入WTO后,景德镇的陶瓷业也面临着一个重生的机遇,国外先进管理水平和先进经营理论的引进,高科技的吸收转化,市场规模的扩大,商业规则和竞争规则的规范化,都给予了中国陶瓷业再次振兴的有利条件,景德镇尤其要抓住这次机会.为此,我们必须对景德镇陶瓷业的未来发展战略进行新的调整,以适应新世纪新的挑战.

Let-7a对尤文氏肉瘤细胞生物学行为的影响

目的:探讨微小RNA(microRNA,miRNA)let-7a对尤文氏肉瘤A673和SK-ES-1细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制。方法:将成熟的let-7a片段(has-miR-let-7a mimic)转染至A673和SK-ES-1细胞中,实验分为转染组(转染has-miR-let-7a mimic)、对照组(转染has-miR-let-7a mimic-control)和未转染组(仅加入脂质体)。Has-miR-let-7a mimic转染后,应用实时荧光定量-PCR法检测细胞中let-7a的表达,CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,FCM法检测细胞的周期分布和凋亡变化,Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测细胞中细胞周期依赖性激酶6(cyclin dependent kinase 6,CDK6)、Rb和磷酸化-Rb(phospho-Rb,p-Rb)蛋白的表达。结果:与未转染组和对照组比较,转染has-miR-let-7a mimic后的A673和SK-ES-1细胞中let-7a的表达水平明显上调(P<0.01),细胞增殖受到抑制(P<0.01),G0/G1期细胞所占比例上升(P<0.01),细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.01),细胞的迁移和侵袭能力明显下降(P<0.01),细胞中CDK6和p-Rb蛋白的表达水平明显下降(P<0.01),而Rb蛋白的表达水平无明显变化。结论:Let-7a可抑制尤文氏肉瘤A673和SK-ES-1细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进其凋亡,这一作用可能部分依赖于let-7a靶向抑制CDK6的表达。