腹泻仔猪病原性大肠埃希菌毒力因子分布与耐药性分析

为了探索仔猪大肠埃希菌性腹泻的发病机制、大肠埃希菌毒力因子变迁以及与耐药性可能存在的关系,在直肠棉拭采集浙江省规模猪场腹泻仔猪病料,经细菌分离纯化、形态学结合PCR鉴定以及小鼠致病性试验得到124株病原性大肠埃希菌基础上,应用PCR分析其毒力因子,采用K-B法及耐药性专用软件Whonet测定并分析其对抗菌药物的耐药性,最后,通过Logistic分析分离株毒力因子与耐药性的相关性。结果表明:菌毛阳性分离株(F4+和F41+)占总菌株数的7.26%(9/124),首次检测到毒力因子EAST1、PAA和AIDA-I,其中EAST1检出率高达19.68%(24/124),而PAA和AIDA-I阳性率较低,分别为4.84%(6/124)和2.42%(3/124);分离株对苯唑西林(100%)、复方新诺明(97.6%)、利福平(97.6%)、多西环素(96%)、羧苄西林(93.5%)、氨苄西林(93.5%)、阿莫西林(93.5%)耐药严重;链霉素与氨苄西林(75.45%)、恩诺沙星(65.45%)、复方新诺明(78.18%)、庆大霉素(63.64%)、多西环素(96%)、氟苯尼考(50.91%)间交叉耐药明显。分离菌株100%呈多重耐药,其中以14～16耐药最多(43.31%);阿莫西林/克拉维酸(P=0.046)和多西环素的耐药性(P=0.020)与大肠埃希菌黏附与脱落病变eae(E.coli attaching and effacing)基因显著相关,多黏菌素B(P=0.004)和氯霉素的耐药性(P=0.013)与EAST1显著相关。结合以往资料,我们认为大肠埃希菌毒力因子已发生明显改变,耐药性更趋严重,且二者之间存在相关性,需深入研究以更好制订大肠埃希菌病有效防控措施。

应用DNA条形码技术对口岸截获鱼翅物种进行鉴定与分析

利用2种DNA条形码技术对鱼翅样本进行鉴定,探讨不同条形码基因对鱼翅物种鉴定的可靠性。本研究应用通用引物扩增口岸截获28个鱼翅的线粒体16S核糖体RNA基因(16S rRNA)和细胞色素氧化酶Ⅰ基因(COI)部分序列,将测序得到56条鱼翅物种基因序列与GenBank数据库内已知鲨鱼物种参考序列进行比对和系统发育树分析。结果表明,通过2种基因序列条形码分析,样本隶属于2目4科6属13种,且均列入《CITES公约》附录Ⅱ。基于16S rRNA序列的鉴定结果与基于COI序列的鉴定结果基本一致,其中,16S rRNA基因未能鉴定出来小眼双髻鲨和小尾真鲨,COI基因无法区分镰状真鲨和短尾真鲨,表明16S rRNA和COI结合应用可以对大部分鱼翅进行准确鉴定。系统发育树显示,同一物种的不同个体与相关参考序列在聚类关系中形成单系分支。本研究可在实际应用中推广,为滋补品真伪市场监督管理,以及口岸进出口快速鉴定鱼翅物种等提供更加科学准确的依据。

基于近红外光谱的象牙鉴定

中国已经全面禁止了象牙交易,但象牙的走私并未因此而终止。对象牙及其制品的鉴定是打击走私一个重要环节。传统的形态学鉴定法,是基于横截面上施氏结构的有无,但有的象牙本身缺少特征纹路,有的则经过雕刻加工后纹路消失,这类样品往往无法鉴定。从分子生物学角度鉴定象牙具有更高准确性,象牙DNA含量极低,象牙中提取DNA的难度较大。已有学者采用光谱技术鉴定和区分象牙等材质,并表明采用拉曼光谱和近红外光谱的短波区域可以区分象牙及其类似物(其他动物牙齿)。采用近红外光谱的长波波段1000~1800 nm,通过建模的方式建立了象牙的鉴别方法。以非洲象(Loxodonta spp.)象牙、亚洲象(Elephas maximus)象牙、猛犸象(Mammuthus spp.)象牙为校正样品集,其他非象牙材质制品,包括抹香鲸(Physeter macrocephalus)牙、河马(Hippopotamus amphibius)牙,象牙果(Phytelephas macrocarpa),模仿成象牙的塑料制品等为验证样品集,采集了230件样品共383条近红外光谱信息。比较了象牙样品颜色和厚度等对光谱鉴定结果的影响,建议扫描具有该物质典型颜色部位,同时取样品厚度大于1 mm的部位进行扫描,否则易造成误判。基于象牙光谱4个较敏感波段,1160~1200、1430~1500、1680~1710和1720~1750 nm,以及SIMCA(soft independent modeling by class analogy)定性分析方法,建立象牙的鉴别模型。建模过程中,在平衡假阳性率和假阴性率后,推导出本模型的最佳主因子值为2和F值为0.21。采用所建立的模型鉴定样品,对象牙的识别准确率达到100%,对角制品、塑料仿制品以及象牙果仿制品等伪品的识别率也达100%,但对质地较相近的其他动物的牙齿,如野猪牙、抹香鲸牙等,则易错鉴为象牙,需要结合其他方法做进一步的鉴定。光谱模型鉴定方法具有无损、简便等特点,同时通过模型鉴别光谱图形较人为观察更加客观和高效,因此较适合作为监管部门现场执法用的快速查验初筛方法。

利用TaqMan微流控阵列同步检测多种动物源性成分

利用TaqMan微流控阵列(TaqMan■array microfluidic card)技术,将24种(类)动物物种的实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)的引物探针集合在同一个阵列上,以实现多物种高通量同步检测,并对该方法的重复性、特异性和灵敏度进行验证。用变异系数(coefficient of variation,CV)表示一块阵列板内,同一物种成分检测的重复性。结果显示:66个CV值中,11个低于1%,15个大于2%,其余40个介于1%~2%之间,没有一个物种成分的CV值高于3%。P值显示的是不同阵列板间同一成分检测的重复性,22个物种成分的P值只有1个小于0.05,显示为板间存在差异,其他21种成分的板间差异均未达到显著水平。因此,本研究对多数物种成分的检测,不论板内还是板间都有较好的重复性。特异性检测中未发现TaqMan微流控阵列中出现假阳性的结果,但有2种成分的检测出现了假阴性。TaqMan微流控阵列的检测灵敏度没有高于单重荧光定量PCR,在22个检测样品中,10个物种成分检测的灵敏度降为原来的10%,1个甚至降低为原来的1%,其余11个灵敏度和单重荧光保持一致。总体而言,TaqMan微流控阵列技术在重复性、特异性和灵敏度方面都能满足物种成分真伪鉴定的需求,为同步鉴定多种动物源性成分提供了一种新的方法。

基于单核苷酸多态性位点的土沉香物种鉴定

对土沉香Aquilaria sinensis,云南沉香A. yunnanensis和马来沉香A. malaccensis 3种沉香属Aquilaria植物的ITS序列进行PCR扩增和测序,并通过DNAMAN软件筛选出单核苷酸多态性(SNP)位点,土沉香序列第236位上的碱基为C,而云南沉香和马来沉香为T,设计出土沉香特异性引物AS-F,AS-R和探针AS-P。实时荧光定量PCR实验表明,该引物探针能特异性扩增土沉香,且检测灵敏度可以达到0.01ng·μL^(-1),是一种快速、灵敏的鉴定方法。

基于ITS序列的DNA条形码技术鉴定红豆杉属植物

DNA条形码技术是一种快速、简便、准确的物种鉴定方法。本研究利用DNA条形码技术对南方红豆杉Taxus wallichiana var.maire样品H1,H2,H3,H4;东北红豆杉T.cuspidata样品D1,D2和欧洲红豆杉T.baccata样品EU1,EU2八个样品的ITS1-18S序列进行PCR扩增和测序,将测序结果与GenBank中的同源序列进行比对分析。结果表明,H1,H2,H3,H4与南方红豆杉的序列相似性最高,D1,D2与东北红豆杉T.cuspidata的序列相似性最高,EU1,EU2与欧洲红豆杉T.baccata的序列相似性最高。用邻接法(NJ)构建ITS1-18S序列的系统进化树(boostrap1000次重复),结果表明,H1,H2,H3,H4和南方红豆杉聚为一枝;D1,D2与东北红豆杉聚为一枝;EU1,EU2与欧洲红豆杉聚为一枝。上述分析结果表明:H1,H2,H3,H4为南方红豆杉;D1,D2为东北红豆杉;EU1,EU2为欧洲红豆杉,与采集地样品信息完全一致。故可以利用引物ITS1-18S从分子水平区分红豆杉属Taxus植物。

三重real-time PCR同步检测黄牛、水牛和牦牛成分

为准确快速地鉴定黄牛、水牛和牦牛的成分,研发具有这3种牛特异性的引物和探针,并建立单重、双重和三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法,同步检测上述3种牛的成分。单重real-time PCR检测时,3种牛的检测灵敏度均为0.025 ng/μL;双重real-time PCR检测时,两两组合的引物探针含量比例为1∶1时,黄牛的检测灵敏度降低至0.1 ng/μL,而水牛和牦牛仍为0.025 ng/μL;对三重real-time PCR检测体系进行优化,当黄牛、水牛和牦牛3组引物探针的含量比例为3∶3∶2时,检测灵敏度最佳,黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1 ng/μL,而牦牛的灵敏度仍可达到0.025 ng/μL。但上述双重和三重real-time PCR检测的灵敏度,是建立在3种牛的含量比例为1∶1∶1的情况下,若3种牛的比例差异较大,特别是黄牛和牦牛的含量比例差异较大时,如比例为9∶1时,含量低的成分会存在漏检。因此,在对整块肉的样品进行检测时,可采用三重real-time PCR的方法同步检测3种牛的成分;若样品可能为上述3种肉的为混合物,如肉糜、肉松等,则建议采用单重real-time PCR检测。

羽绒中DNA提取方法及鸭绒鹅绒成分的定量检测

为提高用PCR法鉴定鸭绒鹅绒的准确度,提高羽绒中DNA的提取效率,优化了DNA提取方法;同时为了便于对羽绒制品的真伪鉴别,建立了羽绒中鹅绒鸭绒等的定量计算方法。通过比较5种前处理方法和4种抽提试剂盒及其组合间的抽提效率,建立最佳的抽提程序。利用荧光PCR定量的优势,建立了羽绒中的鹅绒鸭绒比例定量计算的方法,并将计算得到的值与预设的混合比例加以比较。经验证,本研究建立的鹅绒鸭绒等定量计算方法能准确反映含量变化的趋势,可作为一种有效的辅助手段对羽绒制品进行真伪甄别。

单核细胞增生李斯特菌和致病性弧菌的双重肽核酸原位荧光杂交检测

为了同步快速检测单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)和致病性弧菌,建立了它们的双重肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)原位荧光杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测方法。在用单重PNA探针分别检测单增李斯特菌和致病性弧菌的基础上,建立了可同步检测它们的双重PNA荧光检测方法,优化了适合这2种菌同步双重杂交的固相荧光原位杂交检测参数。在标记的荧光为FAM和Cy3的情况下,使用Leica DM 6000B荧光显微镜对4种荧光滤光模块I3、L5、N21和Y3的检测效果进行比较,结果表明:在进行双重荧光检测时,建议选择L5和Y3的组合分别观察绿色荧光和红色荧光。比较2种菌液体积比例对检测结果的影响表明:当比例从1∶1调至1∶9时,2种菌可同时在2个检测通道中被检测到;当比例调至1∶19时,量少的菌则很难被观察到。综上表明:2种PNA探针分别被标记上FAM和Cy3荧光后,可使用Leica DM 6000B荧光显微镜在L5和Y3滤镜模块下分别进行绿光和红光的观察。说明若选择合适的荧光及荧光滤光模块,可使用普通荧光显微镜完成单增李斯特菌和致病性弧菌的PNA-FISH同步检测。

暗色刺参的实时荧光PCR鉴定

暗色刺参(Isostichopus fuscus)已被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)目录。为精确辨别和有效保护该物种,作者进行了精准鉴定暗色刺参的实时荧光PCR方法的研究。在GenBank中收集暗色刺参及近似种海参的线粒体序列,使用海参的线粒体基因中细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(Cytochrome oxidase subunitⅠgene,COⅠ)进行实时荧光PCR中引物和探针的设计。根据收集到的17种海参的25条COⅠ序列,设计了2组具有暗色刺参特异性的引物探针组合I-fu-1和I-fu-2;同时根据暗色刺参实物测序得到的COⅠ序列,设计了引物探针I-fu-3~I-fu-6。实时荧光PCR检测结果显示:I-fu-1、I-fu-3、I-fu-4、I-fu-6仅在目标物种中检测到阳性,I-fu-2和I-fu-5则在墨西哥刺参(Isostichopus badionotus)中也检测到阳性;对纯暗色刺参样本的灵敏度(指在一次荧光PCR反应中能够检测到暗色刺参的最低浓度)检测显示,I-fu-4优于I-fu-1、I-fu-3和I-fu-6,可达到0.0008 ng/μL,因此认为I-fu-4是最佳的引物探针组合。利用I-fu-4对混合物中暗色刺参进行检测,在同属近似种墨西哥刺参含量高达99.9%,暗色刺参含量低至0.05%的混合样品中,暗色刺参的实时荧光PCR检测也显示了强阳性结果。本研究建立的鉴定方法具有高特异性和灵敏度的特性,有助于快速、精准地鉴定暗色刺参。

浙江地区猪戊型肝炎病毒全基因组序列分析

采用套式RT-PCR方法首次对浙江省猪群中戊型肝炎病毒的全基因组进行分段扩增,并对其两端非编码区采用末端快速扩增法进行扩增,T-A克隆测序后拼接分析。JH-14-03株全基因组共7253 bp,5’端至3’端依次为5’非编码区(25 bp)、ORF1基因(5124 bp)、ORF3基因(339 bp)、ORF2基因(1983)及包含一个18个碱基A组成的Poly(A)尾的3’非编码区(86 bp)。JH-14-03株戊型肝炎病毒与已发表的基因4型戊型肝炎病毒全基因组核苷酸同源性最高,为85.6%-94.7%,显著高于与基因1、2、3型已发表戊型肝炎病毒全基因序列的同源性。分子进化分析显示JH-14-03株与大部分国内猪源和人源戊型肝炎病毒同属于戊型肝炎病毒基因4型毒株。

刺猬紫檀及其3种易混材种辨析

本文主要探讨了刺猬紫檀(Pterocarpus erinaceus)、大果紫檀(Pterocarpus macrocarpus)、非洲紫檀(Pterocarpus soyauxii)和安哥拉紫檀(Pterocarpus angolensis)共4种“花梨”木材的商品名及别名、树木及分布、宏观构造、微观特征和材性及用途。通过对以上信息的辨析,可为准确鉴别刺猬紫檀与其他3种易混材提供参考依据,不仅有助于提升海关等执法部门的查验监管能力,还能保护全球木材资源,促进我国木材进出口贸易健康发展。

东非黑黄檀及其易混材种辨析

本研究由黑檀引入东非黑黄檀及其易混材种的辨析,介绍了东非黑黄檀(Dalbergia melanoxylon)、条纹乌木(Diospyros sp.)、风车木(Combretum imberbe)、成对古夷苏木(Guibourtia conjugata)和阔叶黄檀(Dalbergia latifolia)5种木材的商品名及别名、树木及分布,木材宏观、微观构造特征和材性及用途,通过以上特征的对比,以期为黑檀类易混木材的识别提供科学鉴别依据。

基于DNA条形码技术鉴定金毛狗植物

金毛狗(Cibotium barometz (L.) J. Sm.)被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录Ⅱ,同时也被列入《国家重点保护野生植物名录》,保护级别为二级,是一种珍稀濒危保护植物。本研究通过根、叶、孢子囊群等形态特征对金毛狗及其易混种进行区分,结果表明被垫状金黄色茸毛形状如狗头的植物基部,叶片披针形的小羽片和两侧镰刀形的裂片,以及1~5对孢子囊群是金毛狗的典型鉴定特征。但对于缺失典型鉴定形态的样品,DNA条形码技术则是一种准确可靠的鉴定方法,是传统形态鉴定方法的有效补充。为此,本研究选用通用引物psbA-trnH和trnl对2个疑似金毛狗植物样品分别进行扩增和测序,结果表明2份样品均为金毛狗。本研究建立了准确可靠的形态学和分子生物学方法,为鉴定金毛狗植物研究工作提供了重要参考。

应用分子生物学方法鉴定南方红豆杉

本研究对南方红豆杉(Taxus wallichiana var.mairei)、东北红豆杉(Taxus cuspidata)、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉(Taxus baccata)、密叶红豆杉(Taxus fuana)、喜马拉雅红豆杉(Taxus wallichiana)和红豆杉(Taxus wallichiana var.chinensis)7种红豆杉属植物的ITS序列进行PCR扩增和测序,并通过DNAMAN软件筛选出多态性位点,设计出南方红豆杉特异性引物和探针。实时荧光定量PCR实验表明,该引物探针能特异性扩增南方红豆杉和喜马拉雅红豆杉,且检测灵敏度可以达到0.001 ng/μL,是一种快速、灵敏的鉴定方法。

进口宠物饲料中动植物成分符合性检测与结果分析

为了解进口宠物饲料的质量安全风险,验证宠物饲料的动植物物种成分是否与标签相符,对购自网络平台和实体店的宠物饲料样品,进行了动物源性、植物源性和转基因(genetically modified,GM)成分的实时荧光PCR检测,并对检测结果进行了分析。对136份宠物饲料样品进行动物源性成分检测,有56份样品与标签中成分不一致,不符合率为41.18%,其中网购的宠物饲料不符合率为50.60%,实体店采购的宠物饲料不符合率为26.42%。对27份标明为无谷饲料样品进行植物源性成分检测,有23份样品检出了谷物成分,检出率高达85.19%。对56份含有植物成分的宠物饲料样品进行转基因检测,有21份样品检出转基因植物成分,检出率为37.50%。对上述进口宠物饲料进行动植物成分的符合性检测发现,与商品标识不符合的情况较为普遍,而所谓的“无谷物”饲料往往都含有谷物,同时饲料中使用转基因原材料的情况较常见。实体店的进口宠物饲料,就成分符合性而言,品质优于网络平台。

荧光扫描法快速检测肽核酸分子信标标记的单增李斯特菌

【目的】建立了单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,单增李斯特菌)的肽核酸(Peptide nucleic acid,PNA)分子信标(Molecular beacon)的荧光扫描检测方法,以简化普通PNA原位荧光杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测方法中显微镜观察步骤。【方法】在具有单增李斯特菌特异性的肽核酸探针的5′和3′分别标记报告荧光基团和淬灭基团形成分子信标PNA探针,利用FISH技术和荧光扫描技术对单增李斯特菌进行检测。【结果】用普通PNA探针进行荧光扫描检测时,以N1处理为空白对照,假阳性率11.4%,假阴性率为0;以N2处理为空白时,假阳性率降低至4.3%,但假阴性率上升为18.6%。用分子信标PNA探针进行检测时,用N1为空白对照时,假阳性率8.6%,假阴性率为1.4%;以N2处理作为空白时,假阳性率5.7%,假阴性率为1.4%。与普通探针比较,分子信标PNA探针能有效减少假阳性和假阴性的发生。2种普通PNA探针的杂交成功率分别为83.3%和95.2%;2种"分子信标化"的肽核酸探针的成功率分别为91.7%和90.5%,表明探针两端标记并不会降低与目标菌的杂交成功率。【结论】将液相PNA-FISH和荧光扫描技术结合,通过大通量快速的荧光扫描检测可大幅提高检测效率。同时将肽核酸探针分子信标化,有效的降低了荧光扫描结果的假阳性,并通过了N1和N2两种空白对照处理把假阴性控制在较低的范围。

荧光光谱技术在木材识别中的研究进展

荧光光谱技术是一种新型木材材种识别技术。本文介绍了荧光光谱技术原理及荧光光谱的特点,概述了荧光光谱技术在红木及其他木材识别中的应用,并分析了该方法在木材鉴定中的优势及存在的不足之处,展望了后期研究方向及应用前景,以期为木材鉴定工作者及相关科研人员提供新的研究思路。