益气活血法对脑出血大鼠脑组织促血管生成素-1及其受体表达的影响

目的:通过观察益气活血法中药对脑出血大鼠脑损伤区组织促血管生成素-1(Ang-1)及其受体〔为含免疫球蛋白样环和上皮生长因子样域酪氨酸激酶-2(Tie-2)〕表达的影响,探讨益气活血法治疗脑出血的作用机制。方法:288只SD大鼠被随机分为正常组8只,假手术组、模型组、益气活血组、益气组和活血组各56只。采用型胶原酶诱导脑出血大鼠模型。相应灌服益气活血法代表方补阳还五汤全方及其益气组分、活血组分药物(剂量均为临床70 kg成人用量的3倍)。各组于术后1、2、4、7、14、21和28 d各取8只大鼠,采用苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠脑组织形态学改变,用免疫组化法检测Ang-1及其受体Tie-2的表达,计数阳性血管作为观察指标。结果:HE染色显示正常组及假手术组各时间点未见血肿及局部明显病理学改变,而益气活血组微血管段多于活血组、益气组和模型组。免疫组化研究显示正常组及假手术组不同时间点Ang-1和Tie-2表达均未见明显变化;模型组、益气组、活血组及益气活血组脑出血后1 d即有Ang-1和Tie-2表达,模型组与益气组至21 d达到高峰,随后开始下降,活血组及益气活血组表达高峰时间提前至14 d,至21 d仍维持一定的表达水平。结论:在脑出血微血管系统重建过程中,益气活血法可能通过强化血肿周围Ang-1和受体Tie-2的表达,进而促进脑出血损伤区血管新生的作用,促进脑出血大鼠神经功能的恢复。

脑出血大鼠脑内Angiopoietin-1及其受体Tie-2表达的动态变化

目的:观察与微血管系统重建过程密切相关的促血管生成素(Angiopoietin-1,Ang-1)及其受体含免疫球蛋白样环和上皮生长因子样域酪氨酸激酶-2(tyrosine kinase that contains immunoglobulin-like loops and epidermal growth factor-similar domains-2,Tie-2)在大鼠基底核脑出血后表达的动态变化。方法:用Ⅶ型胶原酶诱导大鼠脑出血模型,采用HE染色观察大鼠脑组织形态学改变,免疫组化法检测第1、2、4、7、14、21和28d血管生成素Ang-1和其受体Tie-2的表达,计数阳性血管作为观察指标。结果:HE染色显示正常组及假手术组各时间点取材未见血肿及局部明显病理学改变,而模型组第4d血肿周围出现微血管段,而后阳性微血管段表达逐渐持续增多,至第21d大量伸入血肿区;免疫组化研究显示正常及假手术组不同时间点Ang-1和Tie-2表达均未见明显变化,模型组大鼠在脑出血后第2d起Ang-1和Tie-2阳性微血管表达明显多于其他两组,而后表达逐渐升高(P<0.01),至21d达到高峰,随后开始下降,28d时仍有表达。结论:在脑出血后,损伤区Ang-1及其受体Tie-2的表达上调,可能通过调节血管生成过程而促进脑出血损伤区微血管系统重建。

MicroRNAs在肝星状细胞活化过程中表达差异谱的研究

目的应用MicroRNAs基因芯片技术筛选静止和活化肝星状细胞差异表达的MicroRNAs。方法用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSCs,并进行体外培养,借助荧光倒置显微镜观察细胞形态,MicroRNAs基因芯片技术和荧光定量PCR检验MicroRNAs在HSCs静止期(2天)和活化期(14天)的表达。结果HSCs的miRNAs表达谱中差异表达miRNAs共21个,其中上调12个,下调9个(P<0.01);荧光定量RT-PCR证实其表达水平在静止和活化期肝星状细胞中均有差异(P<0.01)。结论MicroRNAs基因芯片筛选差异表达miRNAs可望为肝纤维化的基因治疗提供全新的靶标和策略,为肝纤维化的发病机制和诊断治疗研究提供了新的思路。

microRNAs 在肝病中的研究进展

microRNAs（miRNAs）是近年发现的一种以序列特异性方式转录后调控基因表达的非编码单链小分子RNA,长度为21～25个核苷酸.miRNAs可通过与靶基因mRNA的3＇-非翻译区以完全互补或不完全互补的方式结合以调节靶基因的表达.miRNAs参与多种生物学调控过程,对疾病的诊断和治疗具有重要意义.本文就miRNAs的生物合成、作用机制及其在肝病中的研究进展作一综述.

肝内型门脉高压相关基因功能和信号通路的分析

目的肝星状细胞(HSC)的激活受多条信号通路的调节,是肝内型门脉高压发生的关键事件。此研究对静态和活化HSC二代测序结果进行了全面的生物信息学分析,旨在深入了解HSC激活的关键基因及其信号通路。方法通过基因功能分析——功能的显著性分析和KEGG信号通路对差异表达信使RNA(mRNA)进行分析。结果根据基因功能分布发现,HSC转型过程中主要涉及细胞凋亡、增殖、迁移等40种功能,KEGG信号通路提示30条信号通路富集度高。结论在HSC活化向肌成纤维母细胞分化的过程中存在mRNA基因功能和信号通路的差异调控,这为肝纤维化及门脉高压的发病机制和诊治研究提供了新方向。

补阳还五汤对脑出血大鼠脑内促血管生成素-1及其受体mRNA表达的影响

目的通过观察补阳还五汤对脑出血大鼠脑内损伤区促血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）及其内皮特异性受体（endothelial-specific receptor tyrosine kinase，Tie-2）mRNA表达的影响，探讨补阳还五汤的作用机制。方法160只SD大鼠随机分为正常组（10只）、假手术组（60只）、模型组（60只）、补阳还五汤（BYHWD）组（30只），通过立体定位向脑内苍白球注入Ⅶ型胶原酶0．5U建立脑出血模型。其中正常组自由饮水，假手术组和模型组灌服蒸馏水，BYHWD组灌服补阳还五汤。采用免疫组化方法检测假手术组和模型组1、4、7、14、21、28天各时间点Ang-1及其受体表达位置变化。运用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测正常组及其它各组造模术后1、4、7、14、21、28天各时间点Ang-1和Tie-2mRNA的动态变化。结果正常组和假手术组不同时间点Ang-1和Tie-2未见明显表达；模型组1-4天即有Ang-1／Tie-2阳性微血管段在血肿边缘表达，且从7天开始阳性微血管段逐渐伸入血肿区。模型组在脑出血术后1天Ang-1和Tie-2mRNA即有表达，到4天其表达仍然很微弱，与1天比较无明显的差异，随后两者表达逐渐增多，到28天时达到高峰（P〈0．05）；补阳还五汤组在术后第7天开始两者的表达即显著高于模型组同-时间点水平（P〈0．05），且补阳还五汤组在术后21天即达到高峰（P〈0．01）。结论补阳还五汤能促进脑出血大鼠脑内Ang-1和Tie-2mRNA表达的上调，可能在脑出血后微血管系统重建过程中促进血管生成，从而促进损伤组织的修复。

益气活血法对脑出血大鼠脑内TSP-1、TSP-2及其受体CD36表达的影响

目的观察益气活血法对脑出血大鼠脑内损伤区血管新生和凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)、凝血酶敏感蛋白-2(TSP-2)及其受体CD36表达的影响。方法胶原酶诱导建立大鼠脑出血模型,随机分为正常组、假手术组、模型组、益气组、活血组、益气活血组,不同时间点灌注取脑,采用脑微血管银染法观察血管新生情况、免疫组化法观察各指标的表达情况。结果银染法益气活血组14～28d血肿周围及内部新生血管较其他各组多,35d可见血肿完全吸收,其他各组仍有较小血肿。TSP-1与TSP-2分别在造模后4、28d达高峰,CD36在造模后4、28d呈双峰表达。益气活血组4dTSP-1的表达高于模型组(P<0·01),4～7d下降明显,21dTSP-2的表达低于模型组(P<0·05),28d表达高于模型组(P<0·05)。结论益气活血法可能通过调整脑出血大鼠脑内TSP-1、TSP-2及其受体CD36的表达,降低其对血管新生的抑制作用,加快血肿吸收,促进脑组织修复。

益气活血法对脑出血大鼠血肿区血管新生的形态学影响

目的:观察益气活血法对脑出血大鼠脑内损伤区血管新生和血肿吸收的影响及作用机制。方法:180只SD大鼠分为正常组5只,假手术组35只,另140只利用胶原酶诱导建立大鼠脑出血模型后分为模型组、益气组(益气方灌胃)、活血组(活血方灌胃)及益气活血组各35只,不同时间点灌注取脑。采用脑微血管银染法观察各组血管新生情况、测量血肿面积。结果:与正常组及假手术组比较,第1天时,造模的4组大鼠血肿内可见大量结构不清的液化坏死脑组织、炎性细胞浸润,内皮细胞肿胀,血肿周围少量呈毛细血管扩张,中线移位。与造模后的其它3组比较,造模后第7天益气活血组血肿开始明显吸收,35d时部分切片完全吸收(P<0.01)。第14-28天时血肿周围及内部新生血管增多。第28天后各组新生血管开始消退。结论:益气活血法可能通过提高血肿区巨噬细胞吞噬功能,增强血管新生和血肿吸收,以促进脑组织修复。

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础。方法从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒。慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度。将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104ifμ/μL。重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达。BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达。

BMP-7介导的间叶-上皮转化与器官纤维化研究进展

纤维化是各种器官慢性损伤的共同结果。研究发现上皮-间叶转化(EMT)可能是导致多种器官纤维化的潜在机制。目前认为转化生长因子-β1(TGF-β1)能诱导EMT,促进器官纤维化,而骨形态发生蛋白-7(BMP-7)可通过拮抗TGF-β的作用,诱导间叶-上皮转化,改善多种器官纤维化。然而,至今BMP-7的抗纤维化分子机制仍不清楚,对其进行深入研究具有重要意义,可能提供一种纤维化疾病的新治疗手段。

靶向bcl-2基因的shRNA对肝星状细胞凋亡的影响

目的研究短发夹RNA(shRNA)重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞(HSCs)bcl-2基因的表达,观察其对HSCs凋亡的影响。方法重组质粒载体pGPU6-GFP-shRNA由脂质体介导转染HSC-T6细胞株。荧光定量PCR和Western blotting鉴定bcl-2表达;CCK-8法观察质粒转染对HSCs生长和增殖的影响;Hoechst 33258染色观察细胞形态学改变;流式细胞术及caspase-3和caspase-9酶活性检测分析转染后细胞凋亡情况。结果pGPU6-GFP-shRNA能抑制bcl-2 mRNA和蛋白表达;转染后HSC-T6体外生长明显受到抑制;转染后72 h时细胞凋亡率为33.34%,caspase-3和caspase-9酶活性显著增高。结论shRNA重组载体pGPU6-GFP-shRNA能有效地抑制HSC-T6中bcl-2的表达,抑制细胞生长并促进凋亡。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗提供了实验依据。

RNA干扰bcl-2基因的筛选及对肝星状细胞生物活性的影响

目的研究小干扰RNA（shRNA）重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞（hepaticstellatecell，HSC）bcl-2基因的表达，初步观察其对HSC生物活性的影响。方法设计有小发夹结构的3条DNA序列构建重组质粒载体pGPU6-GFP，脂质体转染HSC—T6细胞株以荧光定量PCR和Westernblot筛选鉴定，通过CCK-8法及AnnexinV／PI双标记流式细胞术检测、观察其对HSC生长的影响。结果pGPU6-GFP—shRNA1、shRNA2均能抑制bcl-2mRNA和蛋白表达（P〈0．05），pGPU6-GFP—shRNAl转染HSC．T6株72h后对bcl-2基因抑制达80％，且HSC—T6体外生长明碌受到抑制，早期凋亡率为33．34％～44．12％。结论bel-2小发夹RNA重组载体shRNA1能最有效抑制HSC—T6中bcl-2的表达与细胞生长，促进凋亡，为下一步探索肝纤维化基因治疗提供实验依据。

上皮-间叶转化在肝纤维化中调控机制研究进展

肝纤维化是各种不同病因慢性肝损伤疾病的共同病理转归,其发生机制目前仍未十分明确。近年研究发现,肝脏细胞如肝星状细胞、肝细胞、胆管细胞和肝卵圆细胞等均能发生上皮-间叶转化(EMT),成为肌成纤维样细胞参与肝纤维化发生。TGF-β/Smad、Hedgehog、MAPK、磷脂酰肌醇3-激蛋白激酶B等途径的信号通路激活是EMT发生的重要正向调节机制,抑制这些信号途径能逆转EMT,改善肝纤维化。深入研究EMT的分子调控机制可能成为肝纤维化治疗的新靶标。

BMP-7过表达抑制大鼠肝星状细胞上皮-间叶转化

目的观察慢病毒介导的BMP-7高表达是否能抑制大鼠HSC-T6细胞发生上皮-间叶转化(epithelial to mesenchymal tran-sition,EMT),并能拮抗TGF-β1的促EMT作用。方法构建大鼠BMP-7慢病毒表达载体,体外感染HSC-T6细胞株,将成功感染BMP-7重组慢病毒的细胞给予TGF-β1(5 ng/mL)或溶酶体处理。Real-time PCR检测α-SMA、S100A4、E-cadherin mRNA转录水平。Western blotting检测α-SMA、S100A4、E-cadherin、Ⅰ型胶原蛋白表达水平。结果 BMP-7慢病毒感染HSC-T6后,无论TGF-β1存在与否,real-time PCR检测到α-SMA、S100A4 mRNA转录下调,E-cadherin转录上调。Western blotting显示α-SMA、S100A4及Ⅰ型胶原蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调。实验组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义。结论 BMP-7能有效拮抗TGF-β1对HSC-T6的促EMT作用,可能成为肝纤维化治疗的新途径。

基于现金流指标的财务评价体系改进

本文在深入考察应计制和现金制基础下不同会计信息的特征、利润表与现金流量表的勾稽关系后,设计了现金流指标进行财务评价;并通过剖析典型利润造假公司的财务状况对应计制和现金制指标进行比较分析,检验了现金流指标的有效性和适用性。

MicroRNA-122表达与大鼠慢性肝损伤的相关性

目的观察microRNA-122(miR-122)在大鼠慢性肝损伤早期和晚期的表达及其与大鼠肝损伤的关系。方法用40%CCl4经皮下注射2周和6周后分别建立大鼠早期慢性肝损伤模型(早期病变组,n=10)和晚期慢性肝损伤模型(晚期病变组,n=10),另设正常组(n=10)作为对照。提取肝组织总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,采用TaqMan探针法进行Real-time PCR检测,观察miR-122的表达变化。结果成功建立大鼠慢性肝损伤早期和晚期病变模型;早期病变组和晚期病变组miR-122表达分别下降至正常组的27.0%和5.6%。结论miR-122在慢性肝损伤早、晚期呈进行性下降,与肝损伤存在密切关系。

中国上市银行综合财务评价研究

本文结合专家调查法与层次分析法构建了银行财务综合评价模型,并利用该模型对我国上市银行1998-2007年的财务状况进行综合评价。研究表明:上市银行的财务状况得到不断改善和提高,经营呈现持续增长之势,但各上市银行的财务状况差异较大;总体而言,股份制商业银行的综合财务状况优于国有银行。

大鼠miR-126慢病毒表达载体的构建及其在肝星状细胞中的表达

目的:肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)激活并发生表型改变是肝纤维化形成的关键,本实验期待通过构建慢病毒rno-miR-126,并体外转染HSC,为研究miR-126在肝纤维化中的作用奠定实验基础。方法:PCR扩增miR-126的前体,构建miR-126的重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-miR-126,脂质体法转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度,构建重组慢病毒(Lentivirus,LV)载体(Lv-miR-126),体外转染活化的HSC-T6,荧光显微镜观察荧光阳性细胞百分率,real-time PCR检测miR-126转入水平。结果:经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR-126基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得滴度108>ifu/ml。荧光显微镜下HSC的荧光阳性率在95%以上。Real-time PCR检测证实miR-126转染后获得了较高的表达。结论:成功构建大鼠慢病毒载体Lv-miR-126,并可在体外高效稳定表达,为本研究后续对miR-126靶点验证和功能研究奠定实验基础。

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆微小RNArno—miR-一16，构建其慢病毒表达载体pLV—miR-16并包装成慢病毒颗粒，为进一步研究miR一16的功能奠定了实验基础。方法从大鼠细胞基因组中用PCR的方法扩增miR-16的前体，构建了miR-16的重组表达载体pLV—miR-16，脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物（pPACK—GAG、pPACK—REV和pVSV）共转染包装细胞293TN细胞，包装产生慢病毒，以293TN细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达水平测定病毒滴度。结果经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实，成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光，并测得10^8〉ifu／ml。结论成功构建大鼠慢病毒载体pLV—miR-16，为深入研究rno—miR-16的生物学功能奠定了基础。

miR-126报告基因载体的构建及其功能鉴定

目的:根据miR-126的预测靶点构建荧光素酶报告基因重组质粒,并进行功能鉴定。方法:利用sanger数据库提供的miR-126靶序列设计引物,PCR扩增目的微小RNA(microRNAs,miRNAs)靶基因3'非编码区(three-prime untranslated regions,3'UTRs)序列,PCR产物双酶切,后连入经过同样双酶切的pGL3-control载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α,进行阳性克隆鉴定。同样,将候选靶基因3'UTRs突变,突变型3'UTR克隆入pGL3-control报告载体,构建野生型和突变型的报告基因重组质粒。将野生型和突变型的报告基因载体分别和化学合成的microRNA以及内参质粒共转染293TN细胞,进行双荧光素酶检测。结果:成功构建miR-126报告基因野生型和突变型重组质粒pGL3-VEGF-A-3'UTR和pGL3-VEGF-A-3'UTR,质粒测序及酶切结果完全正确。瞬时转染实验显示,过表达miR-126能直接抑制VEGF-A-3'UTRs报告基因活性。结论:miR-126对VEGF-A具有靶向调节功能。