PCR-TGGE法检测p53基因突变诊断肺癌淋巴结微转移

背景与目的转移是影响肺癌患者预后的重要因素之一,但在淋巴结内存在少量癌细胞时常规的检测方法难以发现。本研究的目的是探讨检测肺癌相关淋巴结内微转移存在的敏感方法。方法利用温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)方法,对39例原发性肺癌患者的肿瘤组织及其相关的110枚淋巴结,进行p53基因(外显子5,6,7,8)的突变检测,并对部分淋巴结采用无间隔连续切片,证实微转移存在。结果在39例肺癌患者中,23例原发肿瘤检测出p53基因突变,在相应的67枚淋巴结中,40枚淋巴结显示p53基因突变,且与原发灶变化一致;而在常规病理组织学检查时,仅26枚淋巴结存在肿瘤转移。原发肿瘤无p53基因突变者的43枚淋巴结和10枚非瘤患者淋巴结,均无p53基因突变。对常规病理组织学检查阴性,PCR-TGGE检测有p53基因突变的14枚淋巴结,进行无间隔连续切片,在4枚淋巴结中证实有微转移存在。结论p53基因突变的检测发现了肺癌淋巴结中微转移的存在,可以作为常规病理组织学检查的补充。

金属蛋白酶MMP-9可调控型表达与人黑色素瘤细胞侵袭表型的相关性

目的 :探讨金属蛋白酶MMP 9与肿瘤恶性表型的相关性以及其可调控型表达在肿瘤基因治疗中的应用。方法 :利用基因重组技术构建正义MMP 9cDNA四环素可调控型表达载体 ,用脂质体法转染正义MMP 9至早期人黑色素瘤细胞株WM35 (不表达MMP 9)。检测转染后细胞MMP 9表达水平的改变以及体外生长、侵袭能力的变化。结果 :在外源性四环素存在时 ,转染基因不表达 ,细胞表型无明显变化。去除四环素 ,WM35细胞MMP 9的表达及活性增强 ,细胞生长速度加快、锚着非依赖性生长能力增加、体外侵袭能力增强。结论 :正义MMP 9基因的可调控型表达能促进人黑色素瘤细胞的生长和侵袭 ,进一步证明MMP 9在人黑色素瘤细胞侵袭过程中起重要作用。

分子病理学在临床上的应用

目的 :举例说明北京大学基础医学院病理学系目前将分子生物学技术应用于临床病理诊断。方法 :采用PCR、RT PCR、PCR RFLP、TGGE、DNA序列分析及免疫组化等分子病理学方法辅助诊断。结果 :(1)滑膜肉瘤 :有特征性的t(X ;18) (p11.2 ;q11.2 ) ,产生融合基因SYT SSX ,故采用RT PCR法检测滑膜肉瘤的SYT SSX融合基因的转录子有助于滑膜肉瘤的病理诊断 ,SYT SSX融合基因根据基因断裂点位置不同 ,分为SYT SSX1和SYT SSX2两种 ,其中SYT SSX1阳性的滑膜肉瘤预后较差 ,因此可作为预后判断指标。 (2 )大细胞间变性淋巴瘤 :部分病例显示t(2 ;5 )(p2 3;q35 ) ,产生NPM ALK融合基因和融合蛋白 ,通过免疫组化法检测NPM ALK融合蛋白 ,将大细胞间变性淋巴瘤分为ALK(+)和ALK(- )两个亚型 ,ALK(+)预后较好 ,具有判断预后价值。 (3)家族性高胆固醇血症 (简称FH) :研究FH的低密度脂蛋白受体基因 (LDLR)的突变对于遗传监测和动脉粥样硬化的防治具有重要意义。我们采用温度梯度凝胶电泳 (简称TGGE)及DNA测序方法研究LDLR基因突变。 (4 )长期拉米呋啶治疗所致的HBVDNA多聚酶基因YMDD突变的快速检测 :拉米呋啶是目前最有效的抑制HBV复制的药物 ,但长期用药会导致部分患者的HBVDNA多聚酶基因发生YMDD区段突变而对拉米呋啶耐药。

聚合酶链反应检测心肌炎石蜡包埋组织柯萨奇病毒B_3 RNA

报道从心肌炎石蜡包埋组织单一切片(6～8μm)中提取RNA,使用定位于柯萨奇病毒B_3特异编码区(VP_1)的一对引物、通过聚合酶链反应(PCR)进行基因扩增。对PCR扩增产物,采用3′末端生物素标记的柯萨奇病毒B_3的特异寡核苷酸探针进行斑点杂交。结果表明,两例检查的心肌炎标本都是柯萨奇病毒B_3感染引起的病毒性心肌炎。本实验说明,从石蜡包埋的组织标本中提取RNA,进行PCR检测是可行的,为临床病理进行分子生物学研究开辟了一条新途径。

分子信标荧光探针检测结核分枝杆菌的临床应用

目的:探讨分子信标荧光探针检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:应用设置内参照的分子信标荧光探针检测178例肺结核标本,并与痰涂片和培养结果进行比较。结果:肺结核组分子信标荧光探针阳性率显著高于痰涂片和培养,检出率分别为56.2%(100/178),34.8%(62/178)、34.8%(62/178)。结论:分子信标荧光探针具有较高的灵敏度和特异度,对结核病的辅助诊断有一定的临床意义。

新月体性肾小球肾炎的病变发生机制

对22例新月体性肾小球肾炎用光镜、电镜、免疫病理学方法进了病理学研究。免疫复合物沉积(12例)、抗基膜抗体(3例)及不明原因(6例),均可严重损伤肾小球,血液有形成分积纤维蛋白涌入肾小囊,导致新月体形成。新月体细胞具有肾小囊上皮细胞的超微形态,细胞间有基膜样物质形成,单核巨噬细胞弥漫、均匀地分布于肾组织,从而证明新月体主要由上皮细胞增生而形成。

脑缺血、缺氧神经细胞超微结构变化的实验研究

本研究利用心室纤颤引起家兔大脑急性缺血、缺氧。取脑组织行电镜观察,发现:脑神经细胞完全缺血、缺氧3min后,首先出现粗面内质网扩张,部分核蛋白体脱失和游离;接着线粒体肿胀、嵴减少或消失,严重者粗面内质网和线粒体可是空泡变;细胞核染色质溶解,核膜扩张,核膜孔扩大;细胞膜膜孔增大。暗细胞的出现是一个重要特点。作者认为.在急性完全性脑缺血、缺氧早期观察到暗细胞可分为两种,一种是神经细胞缺血、缺氧时形态学变化的表现之一;另一种是退行性变的神经细胞.在实验组和对照组均可见到。

165例胃肠道间质瘤中c-kit和PDGFRA基因突变的检测和临床诊断意义

目的探讨在中国较大样本的胃肠道问质瘤（GIST）中c-kit基因和PDGFRA基因的突变状况，为进一步的生物靶向治疗提供依据。方法用免疫组织化学EnVision法、聚合酶链反应（PCR）扩增和直接测序的方法，检测165例GIST c-kit基因9、11、13和17号外显子突变以及PDGFRA基因12和18号外显子突变。结果病理组织学诊断的165例GIST病例中有155例（94％）免疫组织化学显示CD117阳性。在CD117阳性的GIST中，c-kit基因总突变率为76．1％（118／155）：分别为11号外显子67．1％（104／155）、9号外显子7．1％（11／155）、13号外显子1．3％（2／155）和17号外显子0．6％（1／155）。绝大多数为杂合性突变，少数为纯合性突变。11号外显子的突变位点多集中在5’端的经典热点，其次为3’端的框内串联重复。后者主要以核分裂象少的老年女性胃部病例多见。9号外显子突变代表一类发生在年轻男性体积较大的小肠病变。13号外显子发现一处新的突变点L641P。PDGFRA基因突变见于50％（5／10）CD117阴性病例，均为18号外显子突变，包括常见的D842V点突变和一个框内843-846处IMHD缺失伴有S847T的新突变。PDGFRA基因突变多见于发生在后腹膜／网膜的具有高度侵袭危险性的病例。结论中国GIST病例大多数存在c-kit基因和PDGFRA基因的突变，且在基因突变类型和肿瘤原发部位问有非随机的联系。除了发现几个新的突变形式外，国人的GIST似乎和西方国家有些不同的突变特点。靶向治疗需要基因突变分型的启示和指导。

肺癌p53蛋白表达和基因突变与临床病理的相关研究

目的检测肺癌中ｐ５３蛋白表达和基因突变状况及其与临床病理和预后的相关性。方法应用免疫组织化学（ＬＳＡＢ法）和聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）二种方法。结果检测肺鳞癌４６例、肺腺癌４９例，共９５例。免疫组化ｐ５３蛋白总阳性率为５０５％（４８／９５例），肺鳞癌阳性率为５６５％（２６／４６例）、肺腺癌为４４７％（２２／４９例）。ＰＣＲＳＳＣＰ检测ｐ５３基因突变率为４１１％（３９／９５例），肺鳞癌突变率为４７８％（２２／４６例）、肺腺癌为３４７％（１７／４９例）。突变位于第５外显子者有１５例（３８５％）；６外显子３例（７７％）；７外显子１３例（３３３％）；８外显子８例（２０５％）。两种方法检测的符合率为７７９％（７４／９５例）。Ｎ０（无淋巴结转移）、Ｎ１（第一站，转移到支气管周围或同侧肺门淋巴结）、Ｎ２（第二站，转移到同侧纵隔淋巴结及隆突淋巴结）期肺癌ｐ５３突变率分别为２２６％（７／３１例）、４４２％（１９／４３例）、６１９％（１３／２１例），差异有显著性（Ｐ＜０．０２５）；９５例肺癌中，生存率低于３年组和高于３年组患者的ｐ５３突变率分别为５１９％（２７／５２例）?

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶5调节人前列腺癌细胞生长及侵袭的信号转导机制研究

目的 在高转移性的人前列腺癌细胞 1E8中 ,探讨丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 5(MKP5 )在ATP激活丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号通路及相关生物学行为中的作用。方法 构建野生型 pcDL SRα MKP5表达载体 ,稳定转染 1E8细胞并筛选阳性克隆。应用免疫印迹法检测细胞ERK1/ 2和 p38的活化情况。应用生长曲线、体外侵袭实验及软琼脂集落形成实验检测ATP刺激下 ,分别应用MEK抑制剂PD980 5 9及p38抑制剂SB2 0 35 80后各组转染细胞的生物学行为。结果野生型MKP5可明显抑制ATP对 p38通路的激活 ,明显逆转ATP长期刺激下对 1E8细胞的生长抑制作用 ,并明显抑制ATP短期刺激下对 1E8细胞体外侵袭能力的促进作用 ,其作用与SB2 0 35 80相似。PD980 5 9可以部分逆转ATP对转染细胞的体外生长及软琼脂集落形成能力的抑制作用 ,但对ATP短期刺激下对体外侵袭能力的促进作用不明显。结论 在ATP刺激的不同时相里 ,p38、ERK1/ 2通路以不同的方式参与调节肿瘤细胞的生长、侵袭等过程 ,MKP5可通过抑制p38通路的方式参与抑制ATP的这些作用。

PI-3K和MEK1/ERK信号通路在碱性纤维母细胞生成因子诱导乳腺癌细胞低氧诱导因子活化中的作用及机制

目的 探讨碱性纤维母细胞生成因子 (bFGF)活化低氧诱导因子 (HIF 1)的机制及其参与的信号通路 ,为抗肿瘤血管生成的研究提供新的实验依据。方法 以人乳腺癌细胞系T4 7D为对象 ,采用Western印迹方法检测细胞内HIF 1α及磷酸化Akt,ERK1/2 ,p38蛋白质的表达 ;采用双萤光素酶系统检测HIF 1转录活性。结果 bFGF以时间和剂量依赖性的方式诱导HIF 1α蛋白表达 ,同时激活PI 3K/Akt和MEK1/ERK信号通路。分别应用FGFR1阻断剂SU5 4 0 2以及PI 3K激酶抑制剂LY2 94 0 0 2 ,MEK1激酶抑制剂PD980 5 9,p38激酶抑制剂SB2 0 35 80可以明显阻断bFGF对PI 3K/Akt,MEK1/ERK及p38信号通路的激活 ,但只有SU5 4 0 2和LY2 94 0 0 2可以阻断bFGF对HIF 1α蛋白表达的刺激作用 ,阻断效率达 10 0 %。bFGF增加HIF 1的转录活性 ,这一作用分别被PI 3K和MEK1激酶抑制剂抑制 ,抑制率分别为 94 8%和 81 7%。结论 bFGF对HIF 1有明显活化作用。PI 3K/Akt和MEK1/ERK信号通路以不同机制共同调节这一过程 ,其中PI

家族性高胆固醇血症低密度脂蛋白受体基因突变的研究

目的 分析中国儿童家族性高胆固醇血症低密度脂蛋白受体基因突变 ,并建立筛查该基因突变的方法。方法 以一家两患儿及其父母的基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增该基因的启动子和全部 18个外显子。用温度梯度凝胶电泳 (TGGE)分析检测PCR产物 ,对电泳结果异常者进行DNA测序。结果 平行TGGE发现 ,两患儿第 13外显子存在一纯合突变 ,其父母此外显子存在杂合突变。DNA测序证实两患儿第 13外显子发生Ala6 0 6 →Thr纯合错义突变 ,其父母均为此Ala6 0 6 →Thr杂合突变。结论 此家系家族性高胆固醇血症患者的LDL受体基因存在Ala6 0 6 →Thr突变。TGGE结合DNA测序法的建立可用于本症的基因诊断。

SHP2和MKP5在P2Y嘌呤受体介导的人前列腺癌细胞侵袭中的调控机制研究

目的 探讨蛋白质酪氨酸磷酸酶(SHP2)及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶5 (MKP5 )在P2Y嘌呤受体激活人不同转移潜能的前列腺癌细胞系MAPKs信号通路中的调节机制及其与细胞侵袭能力的相关性。方法 构建野生型和突变型SHP2及野生型MKP5表达质粒并分别稳定转染入1E8(高转移)和(或)2B4(不转移)细胞。应用免疫沉淀法检测细胞SHP2的酪氨酸磷酸化的程度,免疫印迹法检测ERK1 /2、p38的磷酸化,用Matrigel穿膜实验检测细胞的体外侵袭能力。结果 ATP可刺激细胞的SHP2发生磷酸化,且在1E8中的激活程度高于2B4。野生型SHP2转染可使2B4细胞中ATP对ERK1 /2的激活时效明显延长;而突变型SHP2延迟并降低1E8细胞中ATP对ERK1 /2的激活水平;两者对细胞p38的活性均无明显影响。ATP刺激可使不转移2B4细胞穿膜数明显增多(比对照组增加72 2% ±14 0% ),野生型SHP2转染可使经ATP刺激的细胞穿膜数进一步增加18 7%。ATP刺激可使高转移1E8细胞穿膜数进一步增加(112 8% ±32 0% ),而转染突变型SHP2可部分(40 9% )抑制ATP的促细胞侵袭作用。转染野生型MKP5在明显抑制p38磷酸化的同时,也能部分抑制ATP的促侵袭作用(抑制率在1E8和2B4分别为22 4%和28 7% )。结论 SHP2正性调节P2Y嘌呤受体介导的ERK活化,并可促进前列腺癌细胞的侵袭能力。

汉族家族性中枢神经系统海绵状血管畸形致病基因的一个新突变位点

目的 探查汉族家族性中枢神经系统海绵状血管畸形(CCM)的突变基因。方法 选择经神经科确诊的2个家系(A及B)和8例散发性中枢神经系统海绵状血管畸形病例。所有受检对象临床表现有癫痫、突发头痛;2例伴有皮肤病变。候选基因为已确认的Krit-1,对该基因的16个编码外显子进行PCR扩增,扩增产物进行直接测序。结果 受检的A家系在第14外显子的第1289(从起始密码子计算,或2308即从mRNA的第一个碱基计算)位核苷酸一个拷贝有C→G的取代,出现编码改变(S430X),形成终止密码子(UGA),使翻译过程提前终止,导致的基因异常属无义点突变。同法筛查,A家族中有1名成员突变未获得遗传;散发病例发现一个正常多态性变化,未见到突变。结论 发现第1例汉族人CCM基因的点突变,也是国际上未见报道的新位点。这一点突变将会导致一种截短蛋白,是CCM发生的基本原因。研究结果可用于症状前基因诊断。

两个家族性高胆固醇血症纯合子家系低密度脂蛋白受体基因分析

目的 分析家族性高胆固醇血症 (familial hypercholesterolemia,FH)低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,L DL R)的基因突变。方法 提取 5个彼此无亲缘关系临床诊断为 FH的纯合子患儿及其家系成员的基因组 DNA,用聚合酶链反应 -单链构象多态性分析方法 ,对 L DL R基因的启动子和全部 18个外显子进行突变检测 ,并对结果异常者进行 DNA测序。结果 在两个家系分别发现A6 0 6 T和 C2 6 3R两种突变。结论 L DL R基因在以上两位点的突变可引起 FH,中国 FH患者的 L DL

不同转移能力的人前列腺癌细胞亚系中p38和c-Jun氨基末端激酶激活机制

目的 研究P2嘌呤受体激动剂ATP对不同转移性的人前列腺癌细胞亚系 1E8和 2B4的p38和c Jun氨基末端激酶 (JNK)信号传导途径的影响。方法 以常规的蛋白免疫印迹法 ,用特异识别双磷酸化p38和JNK的特异性抗体 ,检测活化的 (磷酸化的 )p38和JNK。结果 外源性ATP以时间和剂量依赖性的方式激活细胞内的p38,并且在高转移性的 1E8细胞中ATP诱导的p38活化水平明显高于不转移的 2B4细胞。但是在ATP的作用下JNK未见明显激活。P2嘌呤受体拮抗剂苏拉明(suramin)和p38抑制剂SB 2 0 35 80均可有效抑制ATP对p38的激活 ,抑制率分别为 ,1E883%和 79% ,2B481%和 6 9%。两细胞亚系中 ,G蛋白调节剂百日咳毒素均未明显影响ATP对p38的激活。结论 细胞外ATP在恶性肿瘤细胞中能够诱导激活p38信号通路 ,且p38激活水平在转移性不同的前列腺癌细胞亚系间存在差异。我们的研究为恶性肿瘤细胞生长及转移机制研究提供了有效线索。

即时荧光聚合酶链反应对结节病组织中结核杆菌DNA的检测

目的探讨结核分枝杆菌感染与结节病发病的关系。方法用即时荧光聚合酶链反应法检测了22例结节病患者活检样本中特异性结核分枝杆菌复合物IS6110DNA片段。结果22例结节病患者中,检测阳性11例。聚合酶链反应扩增所得到的IS6110DNA片段,经进一步测序证实与结核分枝杆菌基因序列完全一致。结论结核分枝杆菌感染可能是结节病的重要病因之一。

引物介导的原位标记技术在先天愚型诊断中的应用

先天愚型也称唐氏综合征（Ｄｏｗｎ′ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ），是人类最常见的常染色体异常疾病，约占染色体病的６３％，是先天性智力低下的主要原因之一，其发生率为１／７００。９５％的病人为２１三体，其余为易位或嵌合型。传统的诊断方法是通过染色体显带技术进行核型...

自泌性白细胞介素-6对人肺腺癌细胞系PAa生长的影响

目的 探讨白细胞介素 - 6( interleukin- 6,IL- 6)对人肺癌细胞体外生长的影响。方法 应用逆转录 PCR技术检测人肺腺癌细胞系 PAa IL- 6受体 m RNA、Northern杂交技术检测 PAa细胞IL- 6m RNA;用生物活性检测法测定 PAa细胞所分泌的 IL- 6,并用抗体中和法检测内源性 IL- 6对PAa细胞体外生长的影响。结果 PAa细胞表达 IL- 6受体 m RNA,重组人 IL- 6刺激 PAa细胞生长 ;PAa细胞表达 IL- 6m RNA且分泌有生物活性的 IL- 6,抗 IL- 6抗体抑制 PAa细胞生长。结论 IL- 6对 PAa细胞生长具有调控作用 ,IL- 6为 PAa细胞自分泌生长刺激因子。