p62体募集自噬相关蛋白WIPI2的机制研究

目的探讨自噬接头蛋白(Sequestosome 1,SQSTM1/p62)与磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)复合物的结合蛋白WD重复结构域磷酸肌醇互作蛋白2(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)在空间上定位的调控关系。方法使用CRISPR-Cas9技术敲除正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney,NRK)中的自噬相关基因2A(Autophagy-related gene,Atg2A)、自噬相关基因2B(Autophagy-related gene,Atg2B)和p62基因,建立Atg2A和Atg2B基因敲除的细胞系(Atg2AB double knockout,Atg2AB DKO)以及p62基因敲除细胞系(p62 knockout,p62 KO);透射电镜观察Atg2AB DKO细胞中p62体周围囊泡的定位;活细胞成像观察Atg2AB DKO细胞内p62体与自噬相关蛋白WIPI2的定位变化;光漂白实验观察相变蛋白p62与WIPI2的荧光漂白恢复;通过免疫荧光观察WT、p62 KO和Atg2AB DKO细胞中WIPI2与p62的定位关系;通过蛋白免疫印记检测WT和p62 KO细胞中WIPI2表达量的变化。结果建立了Atg2AB DKO和p62 KO细胞系;透射电镜显示Atg2AB DKO细胞中p62附近聚集了大量囊泡;在Atg2AB DKO中,通过活细胞成像观察到tdTomatop62与WIPI2-GFP高度共定位;荧光漂白实验观察到WIPI2具有流动性;通过免疫荧光观察到,与WT细胞相比,在Atg2AB DKO中WIPI2点的数量明显增多(P<0.0001);与WT细胞相比,p62 KO细胞中WIPI2点的数量和表达量无明显变化(P>0.05)。结论无膜细胞器p62能够与具有流动性的WIPI2阳性囊泡动态融合,促进自噬体的形成。

不同功能化合物对迁移体形成的影响研究

目的探讨SF1670、秋水仙碱、二甲双胍、阿司匹林等4种不同功能化合物对迁移体形成的影响。方法Vigofect化学转染法构建L929过表达Tspan4-mCherry细胞系,分为空白对照组(不含任何药物的完全培养基)、SF1670组(4μmol/L)、秋水仙碱组(0.6μmol/L)、二甲双胍组(32μmol/L)和阿司匹林组(1μmol/L),分别作用11 h;活细胞成像实验拍摄细胞产生的迁移体;Fiji-Image J统计迁移体产生数量,收缩纤维形成面积,直径及长度。结果共聚焦成像结果显示,L929过表达Tspan4-mCherry细胞系建立成功,产生了收缩纤维和迁移体。4种药物对迁移体影响结果显示,与空白对照组比较,SF1670组迁移体产生数量减少(P<0.01),收缩纤维的形成面积和长度被明显抑制(P<0.0001);秋水仙碱组迁移体产生数量明显减少(P<0.0001),收缩纤维的形成面积轻微减少(P<0.05);二甲双胍组细胞收缩纤维形成面积(P<0.05)和直径(P<0.0001)均减少;阿司匹林组细胞迁移体产生数量增加(P<0.01),收缩纤维的直径轻微缩短(P<0.05)。结论SF1670、秋水仙碱、二甲双胍、阿司匹林对迁移体和收缩纤维的形成具有不同程度的影响,迁移体可能在肿瘤、2型糖尿病、炎症、心肌梗死等疾病中发挥重要作用。