甘露糖对乳癌细胞增殖及表柔比星化疗敏感度影响

目的探讨甘露糖对乳癌细胞增殖及表柔比星(EPI)化疗敏感性的影响。方法免疫印迹法测定乳癌细胞(BT-549、HCC1937、T-47D、MCF-7)和正常乳腺细胞(MCF-10A细胞)代谢甘露糖的关键蛋白磷酸甘露糖异构酶(MPI)的表达。将MCF-7和T-47D细胞随机分为对照组(含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、甘露糖组(25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖组(25 mmol/L葡萄糖)、EPI组(1μmol/L EPI)、甘露糖联合EPI组(1μmol/L EPI+25 mmol/L甘露糖)和葡萄糖联合EPI组(1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),各组分别加入含相应药物培养液,于有氧条件和乏氧条件下培养,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定甘露糖及甘露糖联合EPI对细胞生长活性的影响,免疫印迹法检测对照组、甘露糖及葡萄糖组T-47D细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax和Bcl-2的表达。结果 MCF-10A、BT-549、HCC1937、T-47D和MCF-7细胞中MPI表达差异有统计学意义(F=392.680,P<0.05)。与MCF-10A细胞相比,T-47D细胞MPI表达量相对较低,MCF-7细胞表达相对较高,差异有统计学意义(t=25.449、32.857,P<0.05)。有氧条件下,甘露糖组T-47D细胞增殖率较对照组明显降低(t=33.338,P<0.05),MCF-7细胞增殖率与对照组比较差异无显著性(P>0.05);甘露糖联合EPI组T-47D细胞增殖率显著低于EPI单药组,差异有统计学意义(t=22.901,P<0.05);甘露糖联合EPI组与对照组相比MCF-7细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。乏氧条件下,甘露糖组T-47D细胞和MCF-7细胞增殖率较对照组显著降低(t=24.538、35.158,P<0.05),甘露糖联合EPI组T-47D和MCF-7细胞增殖率低于EPI单药组(t=37.986、54.622,P<0.05)。与空白对照组相比较,各加药组T-47D细胞Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2蛋白表达差异无显著性(P>0.05)。结论甘露糖能抑制乳癌细胞增殖,并增加乳癌细胞对EPI敏感性,MPI表达较低的乳癌细胞对甘露糖更敏感。

大鼠视神经挫伤引起视网膜内质网应激

目的 ：观察大鼠视神经挫伤后视网膜内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）变化。方法 ：复制大鼠视神经挫伤（optic nerve crush,ONC）模型。实验分正常对照组、假手术组和ONC组。用TUNEL方法检测细胞凋亡;用蛋白印迹技术检测凋亡相关蛋白表达和ERS相关蛋白表达;观察大鼠视网膜病理变化、检测神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）数量和视网膜内侧部分厚度（retinal thickness of inner part,RTIP）。结果 ：与正常对照组比较,假手术组大鼠视网膜RGCs数量、RTIP未见明显变化;与假手术组比较,ONC 7～21 d组大鼠RGCs数量、RTIP分别呈时间依赖性数量减少、厚度变薄,ONC 3 d组TUNEL阳性细胞数量明显增多、主要分布于RGCs,细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved PARP-1和ERS相关蛋白GRP78、CHOP和caspase 12蛋白表达明显上调。结论 ：ONC能够诱导大鼠视网膜发生ERS,ERS可能是神经节细胞死亡的机制之一。

Wiskoot-Aldrich综合征蛋白家族成员3对乳腺癌细胞增殖、迁移侵袭及伪足形成的影响

目的观察Wiskoot-Aldrich综合征蛋白家族成员3(WASF3)对乳腺癌细胞增殖、迁移侵袭及伪足形成的影响。方法利用免疫蛋白印迹(Western blot)法检测乳腺癌细胞(BT-549、HCC-1937、BT-474、MDA-MB-231、MCF-7、T-47D)及乳腺正常细胞(MCF-10A)中WASF3蛋白的表达量;获取WASF3互补脱氧核糖核苷酸(cDNA),构建过表达及干扰的重组载体SB-16-WASF3和pHB-U6-MCS-PGK-PURO-shWASF3(pHB-shWASF3)。重组干扰质粒经慢病毒包装,感染MDA-MB-231细胞,经抗性筛选建立WASF3基因静默的稳转细胞株。经实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot法验证WASF3的静默及过表达效率;通过克隆形成实验和迁移侵袭实验分别验证细胞克隆形成能力和迁移侵袭能力的变化;过表达载体SB-16-WASF3转染MDA-MB-231细胞,经WASF3抗体和鬼笔环肽(Phalloidin)双染色,观察WASF3过表达对细胞伪足形成的影响。采用单因素方差分析,组内进一步两两比较采用LSD-t检验,两两比较采用t检验。结果Western blot结果显示,不同乳腺癌细胞WASF3蛋白的相对表达量分别为1.07±0.00、0.54±0.11、0.60±0.14、1.36±0.02、0.65±0.05和0.79±0.18,均高于乳腺正常细胞(0.38±0.01,t=134.864、21.289、24.883、55.397、8.892、37.363,P值均<0.05),差异均有统计学意义;且MDA-MB-231和BT-549细胞的表达量相对较高。细胞增殖实验显示WASF3静默组(pHB-shWASF3-1)在24、48、72、96、120 h的增值率均低于对照组pHB-shNegetive Control组(pHB-shNC)及空白对照(Control)(0.92±0.06比1.18±0.05比1.14±0.03、1.42±0.05比1.90±0.12比1.77±0.14、2.02±0.03比2.83±0.08比2.70±0.10、2.78±0.02比3.78±0.03比3.70±0.17、3.22±0.04比4.10±0.12比4.02±0.10,t_(24 h)=7.983、t_(48 h)=9.024、t_(72 h)=23.491、t_(96 h)=66.348、t120 h=17.114;t_(24 h)=8.453、t_(48 h)=5.843、t_(72 h)=15.813、t_(96 h)=13.479、t120 h=19.142,P值均<0.01),差异均有统计学意义,但后两组间差异无统计学意义。pHB-shWASF3-1组克隆形成率[(25.50±2.00)%]低于pHB-shNC组及Control组[(62.33±2.57)%、(64.17±3.21)%,F=204.754]。迁移实验结果显示pHB-shWASF3-1组穿过小室的细胞数低于pHB-shNC组和Control组[(212.33±14.01)个比(357.33±8.02)个比(364.33±9.07)个,F=193.200,P<0.01],差异均有统计学意义,但后两组间差异无统计学意义。侵袭实验结果显示pHB-shWASF3-1组穿过小室的细胞数低于pHB-shNC组和Control组[(151.33±5.51)个比(212.33±14.01)个比(215.00±6.08)个,F=44.269,P值均<0.01],差异均有统计学意义,但后两组间的差异无统计学意义。免疫荧光结果可见,WASF3过表达组的红色信号(WASF3染色)明显高于对照组,绿染的肌动蛋白(F-actin)在细胞边缘明显聚集,细胞伪足伸展更明显。结论WASF3在乳腺癌细胞中呈高表达,静默WASF3后可抑制乳腺癌细胞的增殖、克隆形成及迁移侵袭能力;过表达WASF3后可促进乳腺癌细胞F-action蛋白的堆积,促进细胞片状伪足的形成。