GST pull-down联合质谱筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex 1,BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用Bio GPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO(gene ontology)富集分析。本实验共筛选出108个(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。

小鼠睾丸、附睾和前列腺组织细胞外囊泡蛋白质组分的鉴定及功能分析

【目的】对睾丸、附睾和前列腺组织细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)蛋白质组分进行鉴定,以明确其在精子发生、成熟及功能维持方面所发挥的作用。【方法】用总外泌体分离试剂盒(total exosome isolation,TEI)分别富集小鼠睾丸、附睾和前列腺组织的EVs,用免疫印迹法对EVs进行鉴定。用透射电镜观察EVs的形态,动态光散射粒径分析仪(dynamic light scattering,DLS)分析其直径分布。用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)分析EVs的蛋白质组分,运用DAVID 6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程三方面对筛选出的蛋白质进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析。【结果】用TEI法分离纯化的EVs均可检测到分化抗原63(cluster differentiation antigen 63,CD63)和肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)标记蛋白,表明EVs分离成功。透射电镜下观察EVs呈凹杯状,睾丸组织来源的EVs以直径30~140 nm的居多,附睾组织EVs直径在105 nm处有峰值,前列腺组织EVs直径在50和90 nm处有峰值。用LC-MS/MS分析3种EVs的蛋白组分,睾丸组织EVs筛选到1148种蛋白,附睾组织EVs筛选到902种蛋白,前列腺组织EVs筛选到651种蛋白。睾丸组织EVs特有蛋白有667种,主要参与RNA加工及剪切、精子发生、DNA损伤应答等生物学过程;附睾组织EVs特有蛋白有311种,主要参与转运、代谢和免疫作用等生物学过程;前列腺组织EVs特有蛋白有142种,主要参与代谢活动等。三者共有蛋白277种,主要发挥蛋白质结合、RNA结合等分子功能,参与蛋白质翻译和运输等生物学过程。【结论】睾丸、附睾和前列腺组织EVs分别在精子发生、精子的睾丸后成熟及功能维持中发挥一定的作用。

Dysbindin-1与脆性X相关蛋白1、Y盒结合蛋白2的相互作用

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin-binding protein 1, dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex-1, BLOC-1)的一个亚基,在内体-溶酶体通路的货物运输中发挥一定作用。Dysbindin-1在睾丸组织中的作用尚不明确。本文从前期已筛选到的dysbindin-1在小鼠睾丸组织中的潜在互作蛋白质中,选取2个RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)脆性X相关蛋白1(fragile X related protein 1, FXR1P)和Y盒结合蛋白2(Y-box binding protein 2, YBX2),用GST pull-down和内源性免疫沉淀的方法进行相互作用的验证。结果显示,dysbindin-1与FXR1P和YBX2存在相互作用,提示dysbindin-1在睾丸组织RNA的运输中可能发挥作用。