八角莲愈伤组织和组培品及野生品中鬼臼毒素的HPLC分析

八角莲为中国特有珍稀植物,有很高的药用价值,其所含的鬼臼毒素是具有一定药效活性的环木脂内酯,具有杀虫、抗风湿、抗病毒、抗肿瘤等活性.试验以八角莲叶、叶柄、根为外植体诱导愈伤组织,将组培苗炼苗移栽,成功建立八角莲的组培-移栽体系,同时采用高效液相色谱技术(HPLC)测定并比较八角莲3种愈伤组织、组培苗和野生植株中鬼臼毒素的含量差异.结果显示,以八角莲叶、叶柄、根为外植体,成功诱导出3种愈伤组织;野生八角莲叶中鬼臼毒素含量最高为(7.27±0.75)mg·g-1DW;愈伤组织培养60d,鬼臼毒素含量为(1.98±0.32)mg·g-1DW.通过组织培养可在不破坏野生资源的前提下生产鬼臼毒素,从而为开发鬼臼毒素类抗癌药物提供大量原料.

八角莲多酚氧化酶的酶学性质

以邻苯二酚为底物,研究八角莲多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)粗提液的酶学特性。结果表明,底物邻苯二酚最适浓度为1.0 mol/L,八角莲PPO的最适p H值为7.0,最适温度为30℃,90℃高温处理10 min,八角莲PPO酶活力仅剩11.92%。PPO催化的酶促褐变反应符合米氏动力学方程,相应动力学参数Km和vmax分别为0.230 7 mol/L和769.23 U/min。抗坏血酸、甘氨酸、乙二胺四乙酸、柠檬酸对酶活性具有抑制作用,十二烷基硫酸钠表现出激活作用,亚硫酸氢钠对酶活性的抑制作用强于硫代硫酸钠,Al3+和Cu2+对酶活性具有一定的激活作用,Ca2+对酶活性有一定的抑制作用,Mg2+、Fe2+和Fe3+对酶活性影响不显著。

3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9α-羟基雄烯二酮的制备

9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD)是制备甾体类药物的重要中间产物。3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)能够转化雄烯二酮(AD)产生9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD),该酶由Ksh A和Ksh B两个亚基构成。为获得高效积累9-OH-AD的重组菌株,本研究选择耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis mc2155和戈登氏菌Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395,对其在胆固醇为唯一碳源条件下表达明显上调的ksh A和ksh B候选基因进行克隆,插入到分枝杆菌表达载体p NIT中,构建共表达质粒,并将它们导入分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805中,获得重组菌株。利用重组菌株分别对植物甾醇、胆固醇和谷甾醇进行生物转化,分离纯化转化产物,采用光谱学方法鉴定其化学结构,确定该转化产物为9α-羟基雄烯二酮,说明分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805由积累雄烯二酮变为积累9α-羟基雄烯二酮(9-OH-AD),进而证明导入的候选基因ksh A和ksh B确实为有功能的基因。生物转化实验表明,与胆固醇、谷甾醇相比,植物甾醇作为底物更易于转化;而用来源于耻垢分枝杆菌的ksh A、ksh B构建的重组菌转化率更高,可达90%,具有较高的应用价值。本研究通过对KSH编码基因的异源表达,成功地进行了分枝杆菌生物转化特性的改造,为探索各种甾体药物中间体的工业生产奠定了基础。