生物安全实验室全面开放的安全监督管理模式

根据中山大学生物安全实验室承担教学和科研项目的运行管理与实践,构建了实验室全面开放的安全监督管理模式。该安全监督管理模式是通过运行实验室生物安全管理体系与现代化网络和信息技术、RFID技术、视频监控系统等相结合的管理模式,在确保实验室生物安全的同时提高开放管理的效率,为优秀学生的培养提供了基础研究条件和保障。

临床免疫学和免疫检验实验教学资源网站的建设与应用

临床免疫学和免疫检验是重要的医学检验基础课程,建设临床免疫学和免疫检验教学资源网站,对提高检验医学教学的质量、提高学生学习的兴趣将有重要的作用。通过网络和多媒体的特性使实验教学更灵活、主动,从而提高实验教学的效率和质量。本文介绍临床免疫学和免疫检验教学资源网站的建设过程中的主要内容及其在实验教学中的应用。

分子医学实验室质量管理体系的构建与实践

根据分子医学实验室近年来承担实验教学课程的管理与实践，构建了教学实验室的全面质量管理体系，该体系是通过运行组织和管理、文件控制、效果评价、供应质量、开放服务、投诉处理、纠正措施、持续改进、记录管理、内部考核等模式进行管理的，为提高实验教学质量及优秀学生的培养提供了基础和保障。

汕头市人群肠道病毒（十四型）中和抗体测定

对１７２份人群血清进行了肠道病毒十四型中和抗体测定。结果各类型病毒中和抗体阳性率和抗体几何平均滴度（ＧＭＴ）分别为：柯萨奇病毒Ｂ１～６型在３．５～１６．９％和５．１２～５．９２之间；埃可病毒６、９、１５、１９、２４、２５、２７型在１７．４～３４．３％和６．０７～９．０３之间；肠道７１型病毒２６．２％和６．６３。不同年龄组间抗体阳性率比较，经ｘ２检验结果：柯萨奇Ｂ２型、埃可６型、２７型和肠道７１型四个型差别无显著性（Ｐ＞０．０５），其余十个型其差别有显著或高度显著性（Ｐ＜０．０５）。

大蒜素诱导人膀胱癌细胞株BIU87细胞凋亡的研究

【目的】探讨大蒜素对人膀胱癌细胞株BIU87细胞凋亡的影响。【方法】MTT法检测大蒜素对BIU87细胞生长的影响;倒置显微镜、TUNEL法观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期的变化;半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因bcl-2,bax,caspase-3mRNA表达的变化,比色法测定caspase-3活性变化。【结果】大蒜素能明显抑制BIU87细胞的生长,与大蒜素的浓度和作用时间有关,5mg/L大蒜素作用5d可以杀死50%以上的细胞;可诱导BIU87细胞凋亡,细胞周期阻滞在S-和G2期;凋亡相关基因bcl-2表达减少,bax无明显变化,caspase-3表达及活性增高。【结论】诱导细胞凋亡是大蒜素发挥抗瘤效果的一种重要机制;凋亡发生可能与细胞周期阻滞、bcl-2和caspase-3基因表达及活性变化有关。

亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶检测

目的了解金属β-内酰胺酶在广州地区铜绿假单胞菌中的流行状况及其流行亚型,完善广州地区金属β-内酰胺酶的分子流行病学资料。方法采用双纸片协同法和双纸片增效法对164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌筛选金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,采用PCR检测5类金属β-内酰胺酶的编码基因(IMP家族、VIM家族、GIM-1、SPM-1和SIM-1),利用生物信息学的方法对检测到的金属β-内酰胺酶亚型进行比对分析并制作分子进化树。结果 164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌中筛选出22株金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,IMP阳性15株(9.1%),其中11株为IMP-9亚型,另外4株携带一个新的亚型,命名为IMP-25,VIM阳性5株(3.0%),均为VIM-2亚型,未检测到GIM-1、SPM-1和SIM-1型金属β-内酰胺酶。结论广州地区铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的基因型已经出现多型化的特征,同时存在IMP型和VIM型金属β-内酰胺酶的流行,本次研究发现了一个新的金属β-内酰胺酶亚型(IMP-25),为IMP家族金属β-内酰胺酶的多样性及其分子流行病学资料提供了新的信息。

去甲斑蝥素抑制乳腺癌SKBR3细胞增殖及侵袭转移的体外研究

目的:探讨去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)抑制乳腺癌细胞SKBR3增殖及侵袭转移的机制。方法:体外培养人乳腺癌SKBR3细胞株,采用MTT法检测NCTD对乳腺癌细胞SKBR3增殖抑制能力;流式细胞术测NCTD对SKBR3细胞周期和凋亡的影响;应用肿瘤细胞体外黏附实验、迁移实验和Transwell体外侵袭转移模型检测NCTD对SKBR3细胞黏附、运动、侵袭转移的抑制作用。结果:NCTD可抑制人乳腺癌SKBR3细胞增殖,具有明显量效和时间依赖性,24h的IC50为12.5mg/L;10mg/LNCTD作用SKBR3细胞24h、48h后,特异地使SKBR3细胞发生G2/M期阻滞,G2/M期细胞百分比分别为35.82%、38.70%,G1期和S期细胞较对照组明显减少,亚G1和G0峰DNA含量逐渐增加,24h、48h的凋亡率分别为3.44%和6.17%;SKBR3细胞的体外黏附、运动、侵袭转移能力随NCTD药物浓度提高而下降,表现在黏附抑制率增加,过河时间延长,过膜细胞数减少(P<0.05)。结论:NCTD可通过抑制乳腺癌细胞增殖,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞对基质黏附、迁移运动、侵袭转移等途径抑制癌症的发展。

生物安全三级实验室甲醛熏蒸消毒灭菌效果评价

生物安全三级实验室是按照我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《实验室生物安全通用要求》（GBl9489-2008）等有关病原微生物实验室生物安全法规和标准，以及WHO《实验室生物安全手册》（第三版）中的三级生物安全（biosafty level3，BSL-3）防护标准建立的病原微生物实验室，是专门针对通过气溶胶或其他途径传播，可导致严重后果或生命危险的内源性和外源性病原而特设的适用于临床、诊断、教学、科研的设施。高级别生物安全实验室中所研究的病原体大多数具有气溶胶感染的特性。

生物安全实验室建设与运行管理实践

生物安全实验室为传染病的防治研究提供了必需的公共研究平台。中山大学生物安全实验室结合自身的实际情况,建立了严格的管理制度及各项措施,使实验室的运行管理更规范化、标准化,并实现了实验室资源共享平台的网络预约,确保了实验室设施和仪器设备的有效共享及安全、高效的运行。

新型前列腺特异膜抗原剪接变异体的发现及临床意义初步探讨

目的:探讨前列腺特异膜抗原(PSMA)及其与前列腺癌发生、发展的关系,寻求更为特异的前列腺癌诊断和治疗的靶点。方法:采用RT-PCR和DNA测序技术,克隆PSMA基因新的剪接变异体,并根据其序列信息,设计特异性引物,检测其在不同病变前列腺组织及不同组织来源肿瘤细胞中的表达。结果:发现了一种新的PS-MA剪接变异体,其在前列腺癌、前列腺增生及正常前列腺组织中的表达率分别为92.6%、78.8%及10.0%,且特异表达于前列腺癌LNCaP细胞株,而在前列腺癌PC3细胞株、膀胱癌、肾癌、肝癌细胞株中均不表达。结论:发现了一种新型PSMA剪接变异体(定名为PSMA5),并证实该变异体与前列腺癌及前列腺增生有明显相关性,为研究前列腺癌的发生机制和寻求前列腺癌特异性诊治靶点提供了新的线索。

Matrigel对不同Her2表达的乳腺癌细胞原位成瘤、增殖、凋亡和转移的影响

目的:探讨matrigel对Her2阳性和阴性的乳腺癌细胞原位成瘤、增殖和凋亡的影响。方法:将Her2阳性的人乳腺癌BT474和Her2阴性的人乳腺癌MDA-MB231细胞分为单纯原位移植组和matrigel联合移植组,分别接种于裸鼠乳房脂肪垫(mammary fad pat,MFP),每3d测量肿瘤大小,第30d处死裸鼠,肿瘤组织及相关脏器送病理切片和HE染色及免疫组化,并比较matrigel对2种乳腺癌细胞移植后肿瘤形成时间、成瘤率、肿瘤生长、增殖、凋亡和转移的情况。结果:Matrigel应用后2种乳腺癌细胞的成瘤时间较单纯MFP移植明显缩短(P<0.01);Her2阴性的MDA-MB231细胞的转移率由25.0%上升至37.5%(P<0.05);Her2阳性乳腺癌BT474细胞的转移率,2种乳腺癌细胞的成瘤率、增殖率和凋亡率无明显差异(P>0.05)。结论:Matrigel应用于Her2阳性和阴性乳腺癌的原位移植可以缩短成瘤时间,提高Her2阴性乳腺癌的转移率,但对2种癌细胞的成瘤率、增殖率和凋亡率无明显影响。

同种异型抗原冲击不成熟CD8α^+ DCs抑制T细胞增殖的体外实验

目的:探索同种异基因抗原体外冲击后小鼠优势不成熟CD8α+树突状细胞(DCs)体外抑制T细胞增殖的最佳条件。方法:取SPF级C57BL/6(H-2b)小鼠的骨髓细胞,GM-CSF+IL-4+SCF+Flt3L诱导制备优势不成熟CD8α+DCs,于培养最后1d加入梯度蛋白浓度(0、2.5、5、10和20mg/L)同种异基因(H-2d)小鼠脾细胞抗原冲击DCs。经抗原冲击后的DCs分别与同系T细胞按1∶1、2∶1、4∶1比例共培养,MTT法观察T细胞增殖情况。ELISA法检测上清中细胞因子(IFN-γ和IL-10)的含量。以GM-CSF+IL-4+TNF-α诱导的成熟DCs作为对照。结果:优势不成熟CD8α+DCs与T细胞1∶1共培养时不能有效刺激T细胞增殖,与2∶1及4∶1组相比刺激能力最弱(P<0.05);上清中IFN-γ的分泌明显低于成熟DCs对照组,且经小剂量抗原(<2.5mg/L)冲击时IL-10的分泌高于对照组。结论:经小剂量(2.5mg/L)同种异基因抗原冲击后的优势不成熟CD8α+DCs,与T细胞1∶1混合,是抑制T细胞增殖的最佳条件。

RNAi沉默PSMA基因对前列腺癌LNCaP细胞生物学行为的影响

目的:构建LNCaP细胞PSMA基因的shRNA真核表达载体,探讨其对LNCaP细胞中PSMA基因表达的干扰作用。方法:针对PSMA mRNA序列设计合成3对编码shRNA的寡核苷酸链,退火形成双链,连接入含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的pSilencer2.1-U6-neo真核表达载体,双酶切及测序鉴定。使用脂质体转染的方法将重组质粒导入LNCaP细胞,G418筛选后RT-PCR、Western blotting检测其对PSMA基因干扰作用,并观察对LNCaP细胞生物学行为的影响。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建shRNA真核表达载体p-shRNA1,2,3转染LNCaP后,对细胞PSMA mRNA表达抑制率分别为33.15%、9.26%、41.97%,Western blotting结果显示对PSMA蛋白表达的抑制率分别为26.26%、6.47%、40.69%。选择抑制效率较高的p-shRNA3进行体外生长及侵袭力实验,发现干扰后对LNCaP细胞侵袭力增强,但是对细胞生长影响不大。结论:成功构建了人PSMA基因的RNAi的真核表达载体,并在LNCaP细胞中有效地发挥了对PSMA基因表达的干扰作用,初步发现PSMA在前列腺癌的侵袭中起负向调节作用,为进一步研究PSMA的生物学功能,探索前列腺癌的发病机制奠定一定的实验基础。

铜绿假单胞菌中I类整合子及携带的耐药基因研究

目的了解整合子在广州地区铜绿假单胞菌中的分布状况及其主要类型,研究I类整合子的结构特征并探讨其与细菌多重耐药之间的相关性。方法采用PCR检测3类整合子整合酶的编码基因,并扩增整合子的可变区,运用DNA测序技术分析整合子可变区的耐药基因及其排列顺序,利用生物信息学的方法对检测到的可变区基因序列进行比对分析。结果在20株产金属-内酰胺酶铜绿假单胞菌中,15株检测到I类整合子,未检测到II类和III类整合子,其中一株铜绿假单胞菌整合子全长序列含有I类整合子整合酶、AacA4氨基糖甙乙酰转移酶、IMP-25金属-内酰胺酶、OXA-30-内酰胺酶和CatB3氯霉素乙酰转移酶的编码基因及其相应的基因重组位点,GenBank登录号为EU588392,其中IMP-25为一个新的金属-内酰胺酶亚型。结论广州地区铜绿假单胞菌中存在的整合子类型是I类整合子,并且该整合子可变区携带多种耐药基因盒,其中一个是金属-内酰胺酶新亚型IMP-25,在分子水平上阐述了I类整合子参与铜绿假单胞菌对抗生素的耐药性和多重耐药性。

PSMA基因疫苗抑瘤效应及免疫机制的实验研究

目的:观察表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因疫苗在荷瘤小鼠模型中抑瘤效应并探讨其免疫机制,为前列腺癌的预防和免疫治疗提供实验基础。方法:将PSMA基因疫苗肌注入BALB/c小鼠体内,检测其血清中PSMA抗体水平并观察脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,以sp2/0-PSMA细胞攻击免疫后小鼠,观察小鼠的成瘤率、肿瘤大小、平均瘤重及生存率,评价PSMA基因疫苗的抑瘤效应。结果:PSMA基因疫苗可诱导实验组小鼠产生PSMA抗体,脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,在一定时间内随着免疫次数的增加和时间的延长,抗体水平、脾细胞的增殖和杀细胞毒效应均呈上升趋势。与对照组相比较,实验组小鼠成瘤率低,无瘤生存期延长,肿瘤生长缓慢。结论:PSMA基因疫苗能诱导实验组小鼠产生特异性体液及细胞免疫应答,且有明显的抑瘤效应。

开放性实验教学与学生科研创新能力的培养

“以实验为中心安排教学”是近年来美国高校正在开展的一项极有影响力的实验教学改革计划(简称EBE计划),其教学重点不在知识的掌握而在能力的培养。为了更好地强化学生的实验操作和科研创新能力,在全面查阅EBE计划相关文献的基础上,充分结合自身的实际状况并加以改进,创建了一个以技能训练为基础、以研究性实验为核心、以综合能力培养为目标的开放性实验教学模式。在完成分子医学基本实验课程的基础上,以学生实验小组的形式开展灵活多样的研究性实验和学生科研活动。它不仅能最大限度地拓展仪器使用空间为教学服务,更重要的是能体现先进的现代化教学思想,在实验教改上具有重要的推广意义。

分子医学实验教学资源库的开发与应用

分子医学实验教学资源库的建设是保证和提高实验教学质量，有效利用时间和空间，提高教学效率的重要环节，而其网络特性和多媒体性质则赋予了实验教学更多的灵活性、主动性和形象性。文章介绍了分子医学实验教学资源库的开发过程和主要内容及其在实验教学中的作用。

抗-D抗体Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:于大肠杆菌表达抗-D抗体Fab段基因,为真核载体表达完整的人抗-D抗体奠定基础。方法:将已克隆测序的Fab段基因亚克隆到pComb3噬粒载体,用PCR和限制性内切酶酶切鉴定后于大肠杆菌进行表达,表达产物用SDS-PAGE和ELISA等方法分析。结果:SDS-PAGE电泳表明重组克隆表达了1条约48kD的蛋白条带,ELISA结果显示,所表达的抗体和Rh+的人红细胞呈阳性反应,和Rh-红细胞反应为阴性,阴性对照和Rh+及Rh-红细胞反应均为阴性。结论:于大肠杆菌表达了具有抗原结合特性的人抗-D抗体Fab段抗体分子。

前列腺特异膜抗原剪接变异体的基因结构和多态性分析

目的:了解PSMA剪接变异体的结构及其多样性,探讨前列腺癌的发生机制。方法:应用cDNA末端快速扩增(RACE)的方法扩增剪接变异体5和3末端,并进行序列测定,分析前列腺癌组织PSMA剪接变异体的结构及其多样性。结果:从前列腺癌组织中发现4种新的PSMA剪接变异体,与已往报道的PSMA剪接变异体相比,新发现的变异体在不同位点存在不同程度的插入及缺失。结论:本研究所发现的新PSMA剪接变异体证实和丰富了PSMA剪接变异体的多样性,为寻求前列腺癌特异性的诊断标志物和治疗靶点提供了新的线索和思路。

分子医学实验室仪器设备管理的实践与探索

仪器设备管理是实验室工作的重要内容。分子医学实验室自组建以来,建立健全了仪器设备管理制度,在开放与培训、仪器共享与信息化管理方面进行了探索与实践,提高了仪器设备的使用效益,使实验管理与实验教学工作走上了良性循环、可持续发展的道路。