东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库及新基因分析

目的获得日本血吸虫病新的候选疫苗分子。方法用对日本血吸虫具有天然抗性的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫肝期童虫cDNA文库，阳性克隆转入E．coliBM25．8环化成质粒，抽提质粒DNA，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，插入片段进行核苷酸序列测序，并进行生物信息学分析。结果共获得12个不同的基因，插入片段长度为300～1100bp，其中2个具有完整的开放阅读框，为日本血吸虫新基因，命名为sj—sMf1和sj—sMf2，分别编码93个和61个氨基酸。前者含有cAMP磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点各1个，后者含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2个蛋白激酶c磷酸化位点。结论用东方田鼠血清作为探针筛选到2个日本血吸虫新基因。

牛源隐孢子虫上海分离株的巢式PCR鉴定

目的用巢式PCR鉴定1株自然感染的上海牛源隐孢子虫。方法改良抗酸染色法检查含隐孢子虫卵囊的牛粪,油镜下观察卵囊形态,测量大小。以牛粪中的隐孢子虫卵囊DNA为模板,根据隐孢子虫18SrRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增目的片段,测序,同源性比对,并运用MEGA4.0软件构建系统发育树。结果上海牛源隐孢子虫分离株卵囊呈圆形或椭圆形,大小为(5.6±0.49)mm×(5.2±0.51)mm。扩增出的18SrRNA基因片段为812bp。上海牛源隐孢子虫分离株的18SrRNA与巴西的牛隐孢子虫(Cryptospridium bovis,GenBank登录号为151935628)序列一致性为100%,两者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系最近;与中国青海、蒙古国、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%。结论上海牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫(C.bovis)。

舌形虫和舌形虫病的流行和诊治

舌形虫病是一种危害人体健康的人兽共患寄生虫病,过去被认为是罕见的寄生虫病,但近年来报道的病例明显增多,引起了医学界的重视。随着生活水平的提高,人们的饮食方式也有所改变,尤其是喜食一些生的和半生的动物食品,不良的进食习惯与民间的风俗旧习可能是造成该病传播的重要原因。

日本血吸虫感染适宜与非适宜宿主的免疫学特征初步研究

目的研究3种不同易感性宿主感染日本血吸虫后免疫应答特征的差异,初步探讨适宜和非适宜鼠类宿主感染血吸虫后免疫应答的机制。方法 C57BL/6小鼠、Sprague Dawley(SD)大鼠和东方田鼠(Microtus fortis)各12只,均随机分为感染组和未感染组,每组6只。C57BL/6小鼠、SD大鼠和东方田鼠的感染组每鼠经腹部皮肤分别感染日本血吸虫尾蚴20、200和1000条。感染后42d,剖杀各组动物,观察门脉系统成虫寄生及肝脏肉芽肿情况。收集血清,ELISA法检测细胞因子白细胞介素10(IL-10)、γ干扰素(IFN-γ)和血清特异性抗体IgG、IgG_(2a)及IgG_1的水平。结果感染日本血吸虫后42d,C57BL/6小鼠和SD大鼠均检获日本血吸虫成虫,并在宿主肝脏发现虫卵肉芽肿,而东方田鼠未检获血吸虫成虫及虫卵,肝脏正常。SD大鼠血清中IL-10的含量[(2.21±0.12)pg/ml]明显高于东方田鼠[(1.64±0.39)pg/ml](P<0.05)和C57BL/6小鼠[(0.10±0.04)pg/ml)](P<0.01),而东方田鼠也显著高于C57BL/6小鼠(P<0.01);SD大鼠血清中IFN-γ的含量[(0.21±0.11)pg/ml]均高于东方田鼠[(0.11±0.03)pg/ml]和C57B1/6小鼠[(0.09±0.02)pg/ml](P<0.05),而C57BL/6小鼠与东方田鼠组间差异无统计学意义(P>0.05);SD大鼠IgG(1.53±0.31)、IgG_1(1.48±0.44)、IgG_(2a)(0.41±0.11)水平均显著高于东方田鼠各抗体亚类水平(0.48±0.14、0.15±0.03和0.12±0.06)(P<0.01),C57BL/6小鼠IgG(1.21±0.16)和IgG_1(0.88±0.31)水平也显著高于东方田鼠(P<0.01),3种鼠血清抗体亚类均以IgG_1占优势。未感染组C57BL/6小鼠、SD大鼠及东方田鼠均未检测出IL-10、IFN-γ及抗体亚类IgG、IgG_1、IgG_(2a)的表达。结论与Th2型免疫应答主要相关的细胞因子IL-10在血吸虫非适宜宿主体内水平显著高于适宜宿主,可能在抗血吸虫机制中发挥重要作用。

18Sr RNA基因巢式PCR-RFLP分析两株牛源隐孢子虫分离株

目的18S rRNA巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(restriction fragment length polymor-phism,RFLP)鉴定上海(简称SH-BOV)和徐州(简称XZ-BOV)两株牛源隐孢子虫。方法改良-抗酸染色确定感染隐孢子虫的上海株和徐州株牛粪,提取DNA后经18S rRNA基因巢式PCR扩增,扩增产物测序后用Blast和MEGA软件进行同源性和系统发育分析。同时扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切,且XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后进行RFLP分析。结果通过18S rRNA基因分析,SH-BOV与1株巴西牛隐孢子虫Cryptospridiumbovis同源性为100%,种系发育树上两者在同一分支;XZ-BOV与安氏隐孢子虫C.andersoni同源性为99%,种系发育树上两者在同一分支。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切后,可鉴别出SH-BOV为C.bovis,XZ-BOV为C.andersoni或C.muris。XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后可鉴别出XZ-BOV为C.andersoni。结论上海株牛源隐孢子虫(SH-BOV)鉴定为牛隐孢子虫(C.bovis),徐州株牛源隐孢子虫(XZ-BOV)鉴定为安氏隐孢子虫(C.andersoni)。

髓源抑制性细胞在日本血吸虫感染小鼠脾脏及外周血富集的研究

目的分析日本血吸虫尾蚴感染小鼠体内髓源抑制性细胞（myeloid．derivedsuppressorcells，MDSC）的富集情况．初步探索其在抗血吸虫感染免疫中的作用。方法日本血吸虫尾蚴用腹部贴片法感染C57BL／6小鼠（20条／鼠）24只。感染后1、2、6和8周采集小鼠（各6只）外周血，感染6、8周组小鼠脱颈处死后取脾组织，制备单细胞悬液。各时段同时设健康对照组（各6只）。通过流式细胞术检测小鼠脾组织和外周血中的Gr-1＋细胞、CD11b＋细胞及MDSC比例。通过CD4＋T细胞增殖抑制试验验证感染小鼠Gr-1＋粒细胞的功能。结果感染后6周和8周组小鼠外周血MDSC、Gr-1＋细胞、CD11b＋细胞分别约占总单核细胞（MNC）的38．2％～57．8％和47．1％～77．6％，28．9％～44．6％和40-4％～72．9％，36．0％-48．1％和40-3％-68．3％，显著高于健康对照组（15．1％～20．4％，8．4％～17-3％，9．8％～22．6％）、感染后1周（16．2％～19.8％，13．0％～16.8％，17．6％～19．4％）及2周组（19．8％-29．5％，17．2％～22．2％和20．9％-33.3％）（P〈0．01）。而感染后1周、2周组与健康对照组相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。脾组织与外周血中的MDSC、Gr—1＋细胞、CD11b＋细胞变化趋势一致。此外，从感染小鼠脾组织分离到的Gr-1＋细胞显著抑制刀豆球蛋白诱导的健康小鼠的CD4＋T细胞增殖能力。结论日本血吸虫感染可诱导小鼠体内MDSC富集，且感染Gr.1＋细胞可抑制正常CD4＋T细胞增殖。

细粒棘球蚴抗原EPC1基因的克隆、表达及其免疫诊断的研究

目的克隆、表达细粒棘球蚴EPC1(EgEPC1)基因,鉴定重组抗原的反应原性,并用棘球蚴病患者血清评价其诊断价值。方法从绵羊肝脏棘球蚴囊中分离原头节,提取其总RNA,采用RT-PCR扩增EgEPC1基因,将其克隆至pGEM-T载体,再将其与原核表达载体PET28a(+)连接构建重组质粒PET28a-EgEPC1,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)对纯化的重组抗原进行鉴定分析。以该重组蛋白作为包被抗原建立ELISA方法,检测细粒棘球蚴病患者血清(60份)特异性IgG抗体,同时以多房棘球蚴病(37份)、囊尾蚴病(16份)、华支睾吸虫病(7份)、日本血吸虫病(4份)患者和健康人血清(33份)作为对照,评价重组抗原EgEPC1的免疫诊断效果。结果双酶切鉴定和测序结果均显示重组质粒PET28a-EgEPC1构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组质粒PET28a-EgEPC1在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,产物以可溶蛋白形式存在,重组蛋白EgEPC1的相对分子质量(Mr)约为11 000,可被细粒棘球蚴病患者混合血清识别。EgEPC1对细粒棘球蚴病患者血清的诊断敏感性和特异性分别为78.3%(47/60)和98.3%(59/60),与多房棘球蚴病患者血清交叉反应阳性率为40.5%(15/37)。结论 EgEPC1重组抗原对细粒棘球蚴病具有较好的诊断价值。

3种寄生虫病血清流行病学调查质量评价

目的 对全国弓形虫病、并殖吸虫病和旋毛虫病血清流行病学调查质量进行评价。方法 用相同试剂盒 ,按统一的操作规范 ,对各地血清检测的全部阳性结果血清和随机抽取的部分阴性血清进行复测。结果 弓形虫病、并殖吸虫病和旋毛虫病 2次检测阳性符合率分别为 79. 17% ,78. 0 8%和 6 9. 2 5 % ,阴性符合率分别为 98. 0 0 % ,96 . 91%和 91 .4 7% ,总符合率 98. 14 % ,97 .2 1%和 92 . 84 % ,Kappe值分别为 0 . 8738,0 . 86 11和 0. 774 4。结论 弓形虫病、并殖吸虫病和旋毛虫病血清 2次检测重现性极好 ,Kappe统计量分析回代结果一致性差异有统计学意义 (P <0 . 0 1)。

Toll样受体7敲除对日本血吸虫感染早期免疫应答的影响

目的探讨Toll样受体7(TLR7)敲除对日本血吸虫感染小鼠免疫应答的影响。方法野生型C57BL/6小鼠(WT,n=9)和TLR7-/-敲除小鼠(TLR7-/-,n=9)以腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴(20条)。感染后42 d处死小鼠,以胸主动脉灌注法收集虫体(n=6),并取肝脏进行虫卵计数;分别取WT、TLR7-/-未感染小鼠,WT、TLR7-/-感染小鼠的脾脏(n=3),制备脾细胞悬液;加入日本血吸虫虫卵(250个/ml)刺激72 h,ELISA法检测γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素4(IL-4)和IL-10水平。结果感染后42 d,WT组平均虫荷数为(10.5±3.3)条,每克肝卵数为(38 251.9±4 891.5)个;TLR7-/-组平均虫荷数为(9.8±5.2)条,每克肝卵数为(38 160.9±3 341.0)个,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。在未感染的情况下,TLR7-/-小鼠脾细胞上清液中的IL-10[(1702.6±572.3)pg/ml]和IL-4[(59.5±10.1)pg/ml]水平远高于WT组小鼠[(595.2±386.3)和(8.3±0.9)pg/ml](P<0.05,P<0.01)。感染后42 d,TLR7-/-组小鼠脾细胞上清液中的TNF-α[(43.7±9.8)pg/ml]和IFN-γ[(215.2±35.4)pg/ml]水平低于WT组[(63.4±22.9)和(383.5±253.3)pg/ml],而IL-4[(63.9±33.9)pg/ml]水平高于WT组小鼠[(23.3±11.5)pg/ml],但TLR7-/-组与WT组间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TLR7-/-小鼠在未感染的状态下偏向Th2反应,不影响感染日本血吸虫6周后的免疫应答。

全国囊虫病、包虫病血清流行病学调查质量评价

目的 对全国囊虫病、包虫病血清流行病学调查质量进行评价。 方法 用相同试剂盒 ,按统一的操作规范 ,对各地检测出全部阳性血清和随机抽取的部分阴性血清进行复测 ,并采用符合率和Kappa统计量评价两次检测结果的一致性。 结果 囊虫病、包虫病两次检测结果阳性符合率分别为 5 8.5 4%和 91.12 % ,阴性符合率分别为 98.83 %和96.5 8% ,总符合率分别为 98.85 %和 97.47%。Kappa值分别为 0 .713 9和 0 .93 62。囊虫病二次检测重现性好 ,包虫病二次检测重现性极好。Kappa统计量分析回代结果一致性都具有极显著性意义 (P <0 .0 1)。 结论 本次囊虫病和包虫病血清流行病学调查质量控制较为理想。

猫感染斯氏肺吸虫六个月内排卵量及排卵高峰的观察

为探讨猫感染斯氏肺吸虫囊蚴后 ,虫体是否具有排卵规律性 ,以便为肺吸虫流行病学调查 ,临床诊断 ,疗效考核 ,实验环境灭卵等方面提供参考。用改良 Kato法[1 ] 对猫感染斯氏肺吸虫 (P.s)后定期查粪便达 6个月 ,观察不同时间的排卵量。结果 ,4只感染斯氏肺吸虫猫分别于感染后第 5 7天和第 5 8天 ,在粪便中开始查到排出的 P.s虫卵。用改良 Kato法获得定时定量的 EPG数据。结论认为 Paragonimusskrjabini虫卵具有排卵高峰期 ,第 1个高峰出现在感染后第 4个月左右 ,第 2个排卵高峰出现在感染后第

环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究

目的用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫。方法提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA。根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术的原理，设计4条隐孢子虫特异引物，利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA，以正常牛粪DNA为阴性对照。LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果，绿色判为阳性，棕色判为阴性，对LAMP产物进行电泳分析，观察其特征条带的情况。结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后呈绿色，阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色。隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带，阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物。结论LAMP方法敏感、特异、简便，可用于检测牛粪中的隐孢子虫。

湖北赤壁市农村儿童感染贾第虫的初步分析

目的 评估湖北省赤壁市农村儿童感染贾第虫情况,并初步进行类型分析,为加强贾第虫病的防治提供依据. 方法 从赤壁市进行隐孢子虫调查的儿童粪便样本中,随机抽取20份样本,基于贾第虫磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase,tpi）基因,采用巢式PCR检测粪便标本中的贾第虫,对阳性样本的tpi基因片段进行测序,与GenBank中参考序列进行同源性比对分析,确定贾第虫的集聚体类型. 结果 PCR检测结果显示,1份样本为贾第虫阳性,测序后经分析鉴定为集聚体A,与美国威斯康辛州的污水厂污水分离株1503同源性为99％. 结论 该地区农村儿童存在贾第虫感染,应加强贾第虫感染检测和卫生宣教.

细粒棘球绦虫烯醇酶基因克隆 表达及免疫诊断研究

目的克隆表达细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEno)基因,并对其免疫诊断价值进行初步评价。方法从细粒棘球绦虫cDNA中扩增目的基因,克隆入表达载体pET28a,转化E.coliBL21(DE3),经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,进行SDS PAGE和免疫印迹法鉴定;采用细粒棘球蚴病及其他几种寄生虫病患者的血清和健康人血清,通过ELISA法评价重组EgEno抗原的免疫诊断效果。结果重组质粒pET28a EgEno构建成功。SDS PAGE和免疫印迹法结果显示,重组蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,重组蛋白EgEno相对分子量约为50 kDa,可被细粒棘球蚴病患者血清识别。EgEno对细粒棘球蚴病患者血清的免疫诊断敏感性为81.25%。结论克隆出细粒棘球绦虫EgEno基因并在E.coliBL21(DE3)中表达,重组EgEno对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。

细粒棘球绦虫亲环蛋白基因的克隆重组表达和生物信息学分析

目的克隆表达细粒棘球绦虫亲环蛋白(EgCyP)基因,并对其进行生物信息学分析。方法从细粒棘球绦虫cD NA中扩增目的基因,克隆入表达载体pET28a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达后,进行SDS PAGE和免疫印迹试验鉴定,并对其进行生物信息学分析。结果重组质粒pET28a EgCyP构建成功。SDS PAGE和免疫印迹试验结果显示,重组蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,重组蛋白EgCyP分子量约为22 kDa,可被细粒棘球绦虫感染犬血清识别。生物信息学分析显示该蛋白具有7个潜在的抗原表位。结论成功克隆出细粒棘球绦虫EgCyP基因并在E.coliBL21(DE3)中表达,为进一步研究其免疫原性奠定了基础。

环介导等温扩增技术检测蓝氏贾第鞭毛虫

目的 建立应用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测蓝氏贾第鞭毛虫的方法. 方法 体外培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体,提取DNA.根据GenBank显示的贾第虫序列及环介导等温扩增技术的原理,设计4条贾第虫特异引物,利用LAMP检测蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA为对照,并将不含病原体DNA的纯水作为阴性对照.LAMP产物经SYBR green I显色后观察结果,绿色为阳性,棕色为阴性;对LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察其特征条带的情况. 结果 蓝氏贾第鞭毛虫DNA检测管经显色后呈绿色,隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA及水阴性对照管呈棕色.含有蓝氏贾第鞭毛虫DNA的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,安氏隐孢子虫DNA、恶性疟原虫DNA及阴性对照水无扩增产物. 结论 成功建立了检测蓝氏贾第鞭毛虫的LAMP方法.

东方田鼠免疫抑制模型对日本血吸虫感染性的研究

目的建立东方田鼠免疫抑制模型,初步探讨淋巴细胞在东方田鼠抗血吸虫病机制中的作用。方法成年健康的东方田鼠40只,分成4组(每组10只):免疫抑制+血吸虫感染组、免疫抑制组、血吸虫感染组和空白对照组。免疫抑制剂每周注射3次,连续使用6周,建立东方田鼠免疫抑制的动物模型,用脾淋巴细胞转化试验和ELISA抗体检测进行免疫抑制模型的初步鉴定。在尾蚴攻击感染各组动物后42d,麻醉处死各组动物后进行解剖,灌注冲虫,收集虫体和肝脏虫卵镜检。结果免疫抑制模型淋巴细胞增殖受到显著抑制;免疫抑制组血吸虫抗体水平显著低于未抑制组和空白对照组;免疫抑制和未抑制的东方田鼠均未检出成虫和虫卵。结论成功建立东方田鼠免疫抑制模型,淋巴细胞在东方田鼠抗血吸虫病机制中可能不发挥直接作用。

日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的克隆

目的比较日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的差异。方法提取东方田鼠、SD大鼠、C57BL/6小鼠和KM鼠肝脏DNA,根据东方田鼠特异性DNA序列片段(GenBank登录号:AF277394)设计引物,PCR方法扩增以上4种鼠的基因组特异性DNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定特异条带,纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体,进行DNA序列分析。结果 PCR扩增东方田鼠、SD大鼠DNA分别得到520bp左右的特异扩增片段,同源性为99%。C57BL/6小鼠和KM鼠没有扩增出此特异片段。结论日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠之间特异性DNA序列有高度的同源性。

日本血吸虫新基因Sj79的分子特征及RNA干扰效应

目的研究日本血吸虫新基因Sj79的结构特征及特点,并进行RNA干扰以观察其RNAi效应,为进一步研究其在抗血吸虫生殖发育中的作用及机制提供依据。方法利用NCBI数据库中已公开的日本血吸虫EST序列信息对Sj79的分子结构特征进行分析,并对不同虫期和性别血吸虫的Sj79的mRNA表达水平进行分析,对雌虫进行Sj79的siRNA浸泡干扰,干扰后采用定量PCR检测Sj79转录本相对表达水平变化。结果 Sj79蛋白的开放阅读框含有696对碱基,由一个外显子构成。该基因具有明显的期特异性,在雌虫中转录水平较高。siRNA片段浸泡3 d后,低剂量(20 nmol/L)siRNA-1组Sj79转录本的表达水平[(41.0±12.3)%]低于siRNA-NC组[(103.2±14.4)%],差异有统计学意义(t=3.28,P<0.05);高剂量(200 nmol/L)siRNA-1组[(15.8±10.9)%]、siRNA-2组[(11.1±8.8)%]虫体Sj79转录本的相对表达水平均低于siRNA-NC组[(100.1±6.3)%],差异均有统计学意义(t=13.44、27.84,P均<0.01),前二者对Sj79转录本的转录抑制率可达84.2%、88.9%。si RNA片段浸泡7 d后,仅低剂量siRNA-1[(43.4±4.5)%]、siRNA-2[(62.5±5.4)%]干扰后虫体Sj79转录本的相对表达水平低于siRNA-NC组[(100.4±5.2)%](t=8.33、5.07,P均<0.01)。结论本研究完善了Sj79基因的mRNA序列和基因组信息,了解了其结构特征,并用siRNA干扰法筛选到了有效的si RNA-1和si RNA-2片段,有利于后续观察Sj79分子干扰对体外雌虫产卵的影响。