拮抗青枯雷尔氏菌的放线菌筛选及其防病作用

【目的】青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是烟草的主要病害。本研究从不同生境的土壤中筛选出对青枯雷尔氏菌有较强拮抗作用的放线菌,探究其对青枯雷尔氏菌的生理特征影响以及对烟草青枯病的防治效果,为进一步开发防病微生物菌剂提供理论依据。【方法】利用共培养法和牛津杯法筛出目标放线菌后,通过形态学研究、生理生化试验和多基因系统发育分析对目标菌株进行菌种鉴定。通过96孔板法测定目标放线菌粗浸膏对青枯雷尔氏菌的最低抑菌浓度(MIC)。粗浸膏对青枯雷尔氏菌处理后,检测青枯雷尔氏菌的生长动态变化,并用扫描电子显微镜观察其形态的变化;通过测定β-半乳糖苷酶活性和碘化丙啶(PI)荧光试验以及傅里叶变换红外光谱观察对细胞膜通透性和膜成分的影响;通过测定胞外多糖(EPS)、胞内活性氧(ROS)等探究目标放线菌株对青枯雷尔氏菌的影响。并通过盆栽试验测定目标放线菌株对烟草青枯病的防治效果。【结果】根据形态特征、生理生化试验结果和测序结果,将筛选得到的目标放线菌Sa-21菌株鉴定为雷帕链霉菌(Streptomyces rapamycinicus),对青枯雷尔氏菌的抑菌圈直径达47.9 mm。Sa-21菌株粗浸膏抑制青枯雷尔氏菌的最低抑菌浓度为0.5μg·mL^(-1),对菌体增殖也有明显的抑制作用,并且试验范围内随着粗浸膏浓度的升高抑制作用增强。扫描电子显微镜观察到粗浸膏处理后的青枯雷尔氏菌菌体结构发生改变,导致菌体出现穿孔和皱缩等现象,试验范围内随着粗浸膏浓度的升高,破裂菌体数量增加,皱缩程度增强,并且粗浸膏处理后,碘化丙啶可以穿过细胞膜与胞内物质结合发出荧光,且β-半乳糖苷酶活性显著增加,说明处理后的青枯雷尔氏菌细胞膜通透性提高。进一步研究发现,粗浸膏处理可导致青枯雷尔氏菌胞内活性氧积累,胞外多糖产量下降,说明对细胞膜造成了一定程度的损伤。盆栽防病试验表明,先接种病原菌后喷施发酵滤液10倍稀释液的处理对烟草青枯病的相对防治效果为67.61%,而先喷施发酵滤液10倍稀释液再接种的处理对烟草青枯病的相对防治效果为85.89%。【结论】链霉菌Sa-21能抑制青枯雷尔氏菌菌体增殖、破坏细胞膜结构,对烟草青枯病有较好的防治效果,具有一定的开发潜力和应用价值。

一株拮抗菜豆普通细菌性疫病链霉菌的筛选、鉴定及防效研究

为寻找有潜力的生防菌株,本研究通过共培养初筛和牛津杯复筛从土壤中分离筛选获得123株放线菌。最终获得1株对菜豆普通细菌性疫病病菌Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli(Xap)抑制能力最强的菌株Sa-4,发酵液抑菌圈直径为(31.62±3.23)mm。根据显微形态观察、生理生化特性测定并结合16S rDNA序列分析,鉴定菌株Sa-4为阿维丁链霉菌Streptomycesavidinii。抗菌谱测定结果表明,菌株Sa-4发酵液对多种植物病原菌均具有较强的拮抗作用。稳定性试验结果表明,菌株Sa-4的发酵液具有较好的光稳定性和热稳定性。抑菌机理研究结果显示,菌株Sa-4发酵液对Xap的基因组DNA无明显作用;对Xap蛋白质合成有一定的影响;傅立叶变换红外光谱结果显示,菌株Sa-4发酵液会导致Xap细胞膜表面的物质发生改变;电镜观察结果显示Xap细胞出现皱缩、凹陷等现象。防效结果表明,菌株Sa-4发酵液对菜豆普通细菌性疫病的相对防效可达68.69%。本研究结果为阿维丁链霉菌菌株Sa-4在菜豆普通细菌性疫病的生物防治产品开发提供基础参考数据。

抗番茄早疫病放线菌的筛选与防效研究

为了寻找番茄早疫病的微生物生防制剂,减少该病害对番茄产量与品质的影响.利用共培养法和菌丝生长抑制法从土壤中筛选番茄早疫病害的拮抗菌,并考察其抗菌谱、发酵液稳定性与防效效果.结果表明:成功筛选得到1株拮抗番茄早疫病较强的菌株Sa-6,菌丝生长抑制法显示该菌株发酵液对番茄早疫菌丝抑制率达60.27%;根据形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果,鉴定菌株Sa-6为微黄白链霉菌(Streptomyces albiflaviniger);其发酵滤液对杨树枯萎病菌、西瓜炭疽病菌等5种病原真菌及大豆细菌性斑点、水稻细菌性条斑等8种病原细菌均具有较好的抑制作用;同时菌株Sa-6发酵滤液对番茄早疫病的防效可达90%以上.因此,菌株微黄白链霉菌Sa-6有望为微生物生防制剂开发提供优良的菌种资源.

2,5-二取代吲哚碳酰肼衍生物的合成及活性研究

以对硝基苯肼为起始原料,采用费舍尔吲哚合成法合成中间体5-硝基吲哚-2-羧酸酯(3),经还原合成5-氨基吲哚-2-羧酸酯(4),再与氯甲酸苯酯合成酰胺(5),5在水合肼作用下形成2,5-碳酰肼吲哚(6),化合物6和取代醛反应,合成了7个2,5-二取代吲哚碳酰肼衍生物(7a^7g)。目标化合物经1HNMR、13CNMR、HR-MS结构确证。采用MTT法研究了目标化合物的细胞毒活性。结果显示,目标化合物对所选肿瘤细胞的增殖活性具有一定抑制作用。其中7c对宫颈癌细胞(Hela)、乳腺癌细胞(MCF-7)和人肝癌细胞(HepG-2)的抑制活性与阳性药顺铂活性相近。

链霉菌Sa-21对烟草黑胫病的防效及抑菌作用研究

烟草疫霉引起的烟草黑胫病,是烟草生产上的重要病害之一。为了明确链霉菌Sa-21防治烟草黑胫病的应用潜力,用盆栽试验测定了链霉菌Sa-21的生防效果,并用生长速率法等手段探讨了链霉菌Sa-21对烟草疫霉的抑菌作用。盆栽试验表明,链霉菌Sa-21菌株发酵液对苗期和成株期烟草黑胫病有较好的控制效果,最高防效可达98.39%。菌株Sa-21粗浸膏对烟草疫霉菌丝生长的抑菌中浓度为56.1μg/mL,50μg/mL的粗浸膏处理后可以降低50%的菌丝生物量。菌株Sa-21粗浸膏对烟草疫霉孢子囊的产生、游动孢子释放、休止孢萌发以及细胞膜透性均有抑制作用,100μg/mL的粗浸膏基本能够完全抑制孢子囊的产生,并且对游动孢子释放的抑制率达50%以上;粗浸膏浓度为150μg/mL时,对休止孢萌发的抑制率达94.35%;随着粗浸膏浓度增加,菌丝细胞膜的透性也会加大。研究结果表明,链霉菌Sa-21代谢物对烟草疫霉的生长繁殖产生抑制作用,并为链霉菌Sa-21生防菌剂的开发及其对烟草黑胫病的防治提供了理论依据。