中共上海市（复旦大学附属）公共卫生临床中心党委书记袁正宏教授简介

袁正宏（1966-），医学博十学位，研究员，教授，博士生导师：1985年南通医学院获学士学位，1988午获南通医学院微生物与免疫学硕士学位，1993年获上海医科大学医学博士学位：1995-1996年获欧共体居里奖学金，在英国帝国理工学院圣玛丽医院进修丙型肝炎病毒分子生物学检测技术；

基于微滴数字PCR技术建立单细胞水平研究HBV的方法

在单细胞水平研究肝组织内乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是十分重要的,但相关研究技术尚处于推进阶段,不能满足临床需要。基于微滴数字聚合酶链反应技术(digital droplet polymerase chain reaction,ddPCR),本研究建立了一套单细胞水平绝对定量HBV DNA和RNA的单细胞微滴数字PCR方法(single-cell ddPCR,sc-ddPCR)。通过混合不同比例的HBV阳性和阴性细胞来模拟HBV慢性感染状态下的肝脏,分析此方法检测HBV DNA的线性和检测下限。以cccDNA来源RNA(episome-derived RNA,eRNA)为例,进一步设计针对eRNA的sc-ddPCR检测方案。利用不同来源转录本在结构上的差异,设计针对eRNA的特异性引物探针体系,在HBV肝癌细胞系中验证此引物和探针体系的特异度,并利用梯度稀释的HBV细胞株分析此方法检测eRNA的线性和检测下限。结果显示,本研究建立了基于ddPCR的DNA和RNA的单细胞水平检测方法,该方法表现出良好的线性(HBV DNA:R^(2)=0.9987;eRNA:R^(2)=0.9425),梯度稀释的HBV细胞株均能准确检测出阳性信号,具有高灵敏度(检测下限:HBV DNA为0.16%,eRNA为0.2%)。本研究建立的sc-ddPCR方法可针对多种DNA和RNA进行检测,为进一步研究肝组织内HBV病毒学活动提供了良好的技术支撑,可以更深入地分析肝组织内HBV的病毒学特征,从而有利于HBV治疗策略的优化和研发,具有广阔的应用前景。

反义寡聚脱氧核苷酸（ODN）衍生物抑制乙肝病毒抗原表达的研究

为比较针对中不同基因的ＯＤＮ硫代衍生物阻断乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的抗原表达，合成了与核心蛋白编码基因起始码上游序列（＃１８９３－１９０７），多聚酶蛋白编码基因起始码上游及内部序列（＃２２９７－２３１３，＃２７９７－２８１３）３．５ｋｂＲＮＡ３′端起始负链ＤＮＡ合成序列（＃ｌ８１７－１８３１）互补的寡聚脱氧核苷酸硫代衍生物［Ｃ－ＯＤＮ，Ｐ－ＯＤＮ，ＰＭ－ＯＤＮ，ＰＢＳ－ＯＤＮ］，分别在ＨＢＶ短暂表达和稳定表达细胞培养系统中观察其抑制ＨＢＶ抗原表达的作用。结果发现，当培养液中ＯＤＮ浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ时，四种ＯＤＮ均能抑制ＨｅｐＧ２２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ（乙肝表面抗原）的产生（抑制率分别为：Ｃ－ＯＤＮ，２４．５％；ＰＯＤＮ，１３．４％；ＰＭ－ＯＤＮ，３８．４％；ＰＢＳ－ＯＤＮ，２８．４％）；与ＨＢＶＤＮＡ双体质粒共转染ＨｅｐＧ２细胞后部分ＯＤＮ可明显抑制ＨＢＶＤＮＡ在细胞内表达（ＨＢｅａｇ分泌抑制率分别为：Ｃ－ＯＤＮ，５２％；ＰＭ－ＯＤＮ，７０％；Ｐ－ＯＤＮ，４８％；ＰＢＳ－ＯＤＮ，１８％）。用测定上清中人白蛋白的结果证明，Ｃ－ＯＤＮ的细胞毒作用最低。对Ｃ－ＯＤＮ的作用机理及进一步发展ＯＤＮ的应用也进行了?

用修饰核心基因产物干扰乙型肝炎病毒基因的复制和表达

用修饰核心基因产物干扰乙型肝炎病毒基因的复制和表达袁正宏，闻玉梅，何丽芳，赵苏伶（上海医科大学医学分子病毒学实验室上海２０００３２）关键词乙型肝炎病毒，修饰核心基因，抗病毒制剂乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）进入细胞后，其基因组的逆转录过程需在病毒核衣壳内完成...

朊病毒及其相关疾病

疯牛病是一种目前在国际上受到特别关注的流行病。业已证实,该病为牛食用含有羊痒疫致病因子的脏器所致。尚未确定其病原体,推测与朊病毒有关。迄今尚无疯牛病传染至人引起克雅病的确切证据。采取适当卫生措施可预防疯牛病的发生。

外泌体与病毒感染

外泌体（exosomes）是一种可由多种细胞通过胞吐作用分泌释放到胞外或体液环境中的直径为纳米级别（40-150nm）的膜性囊泡结构，它由胞内多囊泡体（multivesicular bodies，MVBs）和细胞质膜融合形成，内含有独特的蛋白质、脂质和核酸等物质。已知外泌体介导的脂类、蛋白质及编码和非编码RNA的运输，广泛参与了细胞内和细胞间的生理过程，如抗原递呈、先天免疫、肿瘤发生和发展等。

外源导入乙型肝炎病毒增强子Ⅱ片段对乙型肝炎病毒基因表达的影响

乙型肝炎病毒(HBV)基因组由一环状,部分双链DNA分子组成,分别编码S、C抗原X蛋白及多聚酶,这些基因的表达受启动子和增强子序列等的调控。近年国内外学者利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)系统对HBV基因组进行缺失分析,发现了一个新的具有顺式调控HBV基因转录的元件——增强子Ⅱ(EN Ⅱ),它位于1627-1774核苷酸之间。

蛋白质精氨酸甲基转移酶5表观调控cccDNA抑制HBV复制

【据《Hepatology》2017年6月报道】题：蛋白质精氨酸甲基转移酶5通过表观调控cccDNA转录及干扰pgRNA包装抑制HBV复制（作者Zhang W等） 目前认为,慢性HBV感染难以治愈的根本原因之一在于HBV感染肝细胞后会在细胞核内形成共价闭合环状DNA（cccDNA）,并以微小染色体结构形式稳定存在,是病毒持续转录复制及停药复发的源头。已有证据表明组蛋白乙酰化修饰有助于cccDNA转录,但对组蛋白甲基化是否影响cccDNA转录活性及相关宿主因子尚不明确。

病原微生物与宿主细胞相互作用的研究进展

病原微生物和宿主细胞之间复杂的相互作用是感染性疾病发生的基础。近年来,国际上有关微生物与宿主细胞相互作用的研究得到了迅速发展,已形成了一门新的学科——细胞微生物学。研究微生物与宿主细胞相互作用的技术和手段也有了新的发展,已取得了不少突破性的研究成果。我国的微生物学工作者应积极关注、了解和参与这一有可能成为21世纪医学微生物学核心的研究领域。

痢疾杆菌全基因组序列及基因组岛的分析

福氏 2a志贺菌 (Shigellaflexneriserotype 2a)是引起人类细菌性痢疾的主要病原体。本文在国际上首次完成了福氏 2a志贺菌 30 1株 (Sf30 1) (我国细菌性痢疾的优势流行株 )的全基因组核苷酸序列测定和初步分析。该基因组包括一条由 4 6 0 72 0 3个碱基对 (bp)组成的环状染色体和一个含 2 2 16 18bp的侵袭性大质粒pCP30 1以及另外两个小质粒。通过将Sf30 1的染色体序列与其亲源关系相近的非致病性大肠杆菌K - 12菌株MG16 5 5进行比较基因组学研究 ,发现Sf30 1的染色体上有 5 72Kb特异性序列 ,并形成了 32 0个长度大于 5 0bp的“痢疾岛” (Shigella island ,SIs) ,其中大于 1Kb的共计 131个。这些岛共包含 5 19个开放读码框架 (OpenReadingFrames,ORFs) ,多数SIs的一侧或两侧均伴有插入序列元件、转座子或者tRNAs。G +C含量及密码子使用频率等分析显示出部分SIs的外源性。通过结构及ORF编码产物功能的分析 ,鉴别出 9个可能与痢疾杆菌致病性有关的“毒力岛” ,其中

猪乙脑病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

目的建立检测猪血清中流行性乙型脑炎病毒(JEV)IgG抗体的间接免疫荧光试验(IFA)。方法用乙脑病毒感染C6/36白蚊伊蚊细胞制备抗原片,建立检测猪血清中JEV-IgG抗体的IFA方法,并用于猪乙脑血清流行病学调查。结果成功建立特异的猪JEV-IgG的IFA检测方法,并对50份母猪、55份仔猪和65份屠宰猪的血清进行检测。乙脑血清抗体效价≥1:200的分别为88.00%,10.91%和24.62%。结论建立的IFA方法能较好的用于猪血清乙脑流行病学调查。

卡介菌多糖核酸免疫治疗结核病小鼠的实验研究

目的观察卡介菌多糖核酸(BCGPSN)对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫保护作用及其免疫学机制。方法将BALB/c小鼠48只随机分成BCGPSN免疫治疗组和结核菌感染对照组,每组24只。两组小鼠制成结核分枝杆菌感染模型。感染后1周,每天分别腹腔内注射BCGPSN(10mg/kg)或生理盐水(10mL/kg),连续7d。感染后3周和4周每组处死12只小鼠,检测小鼠体重以及肺、脾脏湿重,观察肺脏病理改变,取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数,用real-timePCR法测定肺、脾组织IFNγmRNA、IL10mRNA和IL4mRNA的表达。结果感染后4周,治疗组小鼠体重和脾脏重量高于对照组,肺脏重量低于对照组,且肺部病变较轻。感染后3周和4周,治疗组小鼠肺、脾组织结核菌落均低于对照组,小鼠肺组织IFNγmRNA表达与对照组无差别,IL10mRNA和IL4mRNA的表达低于对照组。感染后3周,治疗组小鼠脾组织IFNγmRNA表达与对照组相似;感染后4周,脾组织治疗组脾组织IFNγmRNA的表达高于对照组。感染后3周和4周,IL10mRNA和IL4mRNA的表达低于对照组。结论BCGPSN可减轻结核病小鼠体重下降,减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量,并增强Th1型免疫反应。

CpGDNA预防小鼠哮喘模型的形成

目的 研究含胞嘧啶鸟嘌呤核苷酸的免疫刺激元件 (CpGDNA)能否预防卵蛋白致敏小鼠哮喘模型的形成。方法 将 18只BALB/c小鼠均分为 3组 ,其中卵蛋白致敏哮喘组 (OVA组 )和CpG预防组 (CpG组 )皮下注射卵蛋白致敏制作哮喘模型 ,然后用卵蛋白激发 2次 ;阴性对照组 (NS组 )皮下注射生理盐水 ,然后生理盐水激发 2次。CpG组在致敏前腹腔注射CpGDNA 10 0 μg/ 10 0 μL ,其他两组不作干预。 3组分别在第 2次激发后 2 4h测外周血OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a,并处死小鼠测肺泡灌洗液 (BALF)中的细胞总数及嗜酸性粒细胞 (EOS)计数 ,肺组织病理切片观察形态学改变 ,并测定脾细胞培养上清液中OVA特异性IFN γ。结果 CpG组BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞明显低于OVA组 ,P <0 .0 5 ;CpG组肺组织炎症反应较OVA组明显减轻 ;CpG组脾细胞培养上清液中OVA特异性IFN γ的浓度明显高于OVA组 ,P <0 .0 5 ;CpG组外周血OVA特异性IgE和IgG1均低于OVA组 ,P <0 .0 5 ;CpG组IgG2a较OVA组为高 ,P <0 .0 5。

新型甲型H1N1流感68例临床分析

目的:探讨上海地区甲型H1N1流感确诊病例的临床特点。方法:分析2009年5月24日至7月1日上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心收治的甲型H1N1流感68例确诊病例的流行病学及临床资料。结果:68例甲型H1N1流感确诊病例的临床特点:(1)不同性别和各年龄段均可感染和发病,但主要见于青少年,女性患者偏多。(2)首发症状多为发热,大多数为中低热,发热持续时间为1～4d;主要症状包括发热(98.5%)、咳嗽(83.8%)、咽痛(52.9%);主要体征为咽部充血(95.6%)、扁桃体肿大(54.4%);少数患者可出现病毒性肺炎。(3)血清C反应蛋白升高和前白蛋白下降比较常见。(4)在奥司他韦治疗的前提下,患者病毒转阴时间1～7d,中位时间4d。结论:此次甲型H1N1流感病毒具有很强的传染性,能在人与人之间传播,并在不同国家扩散。该次流行期间的感染者大多表现出轻微的症状,患者很快痊愈。

卡介菌多糖核酸对肺结核病人外周血细胞因子mRNA表达的调节

目的 :观察活动性肺结核病人外周血单个核细胞 (PBMC)细胞因子信息核糖核酸 (mRNA)表达特点以及卡介菌多糖核酸的调节作用。方法 :活动性肺结核病人和健康志愿者各 15例 ,分离单个核细胞。分 3组进行培养 ,A组为不加刺激物的对照组 ,B组加入结核菌素纯蛋白衍生物 (PPD) ,C组加入卡介菌多糖核酸 (BCG PSN )。检测PBMCγ 干扰素 (IFN γ) ,肿瘤坏死因子 (TNF α)和白细胞介素10 (IL 10 )mRNA表达。结果 :活动性肺结核病人PBMC在A组IFN γmRNA的表达明显低于健康者 ,P <0 .0 1,TNF α与IL 10mRNA的表达与健康人无差异。在B组IFN γmRNA和TNF αmRNA表达与健康人无差异 ;IL 10mRNA的表达增强 ,与健康人比较 ,P <0 .0 1。在C组 ,IFN γmRNA的表达增强 ,仍低于健康人 ,P <0 .0 5 ;TNF αmRNA的表达有增加 ,与健康人比较 ,P >0 .0 5 ,IL 10mR NA的表达无改变。结论 :活动性肺结核病人保护性细胞因子IFN γ减低 ;BCG PSN刺激可提高免疫细胞IFN γmRNA ,但不增高IL

hCGβ在乳酸杆菌中的分泌性表达

目的 :探索乳酸杆菌携带表达 h CGβ避孕疫苗的抗生育作用。方法 :用 PCR从短小乳酸杆菌染色体中扩增得到 S-层蛋白的信号肽序列 ,将其与 h CGβ基因连接后克隆到乳酸杆菌整合型表达载体 p Ilac的 lac启动子下游 ,得到质粒 p Ilac h CGβ,电穿孔转化干酪氏乳酸杆菌 Lb. caseiCECT5 2 76。挑选转化后的耐药菌落 ,在含红霉素培养基中培养 ,抽提其染色体 DNA,PCR及测序鉴定证实 h CGβ基因整合到 Lb.casei的基因组中。h CG放免检测上清及细胞裂解液中的 h CGβ。结果 :h CGβ基因已经整合到 Lb.casei的基因组中 ;细菌产生的目的蛋白约有 3/ 4分泌进入培养上清 ,而加入诱导剂乳糖 2 1 h后 ,上清中的蛋白浓度达到峰值 ,为 440 m IU/ m L。重组菌在无选择压力条件下培养 5 0代后仍可分泌 h CGβ。结论 :h CGβ在乳酸杆菌中得到了稳定的。

CpG寡脱氧核苷酸对慢性哮喘小鼠模型气道炎症的预防作用

目的研究含非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)寡脱氧核苷酸(CpG-oligodeoxynueleotides,CpG- ODN)能否预防或减轻慢性哮喘小鼠气道炎症的发生。方法40只雌性C57BL／6小鼠随机均分为4组,A组(慢性哮喘组)、B组(CpG-ODN干预组)和C组(GpC-ODN对照组)分别腹腔注射卵蛋白致敏,然后用卵蛋白雾化吸入激发以制作慢性哮喘模型,D组(生理盐水对照组)用生理盐水进行致敏和激发。B组在致敏同时(d1, d14)和激发阶段(每2周1次)分别给予60μg／mLCpG-ODN腹腔注射,共6次。C组将CpG替换为鸟嘌呤-磷酸-胞嘧啶(GpC)作为对照。在末次激发24 h后,取血测嗜酸粒细胞(eosinophil,EOS)数,血清IgE、IgG1和IgG2α;收集支气管肺泡灌洗液(bronehoalveolar lavage fluid,BALF)作细胞分类计数;测定肺组织中白介素-4 (interleukin-4,IL-4)、白介素-13(interleukin-13,IL-13)和γ-干扰素的mRNA(interferon-γ,IFN-γ)表达量;以及肺组织病理学检查。结果A组外周血EOS数[(89±10)×104／mL]、血清IgE值[(279±53)ng／mL)、IgG1(A值2．151±0．628)、IgG2α(A值0．772±0．245)、BALF中EPS(6．3±1．3)]×105／mL)及百分比[(18．1±3．0)％]较D组明显增高(P<0．01);且肺组织中IL-4、IL-13和IFN-γ等细胞因子mRNA表达量[(分别为(5．72±3．89)×10-2、(9．45±5．91)×10-2和(3．23±1．69)×10-2)]也明显高于D组(P<0．05)。用CpG-ODN干预后(B组),除IgG2α(A值1．186±0．414)和IFNγmRNA表达量[(18．91±9．85)×10-2]增高外(P<0．05),其余指标均低于A组(P<0．05)。C组的上述各指标与A组相比差异均无显著性(P>0．05)。结论CpG- ODN对小剂量OVA反复激发所致的慢性气道炎症有一定的预防作用。

两株乙型肝炎病毒基因组结构分析及其复制和抗原表达特性的比较

为从全基因组水平研究乙型肝炎病毒 (HBV)的核苷酸结构及复制和抗原表达特性 ,分别从 2例HBsAg和HBeAg阳性、HBVDNA滴度为 10 14 和 10 13 拷贝 /ml的慢性乙型肝炎患者 (编号为 5 6和 2 18)血清中扩增、克隆了HBV全基因组 ,并测定了核苷酸序列。两株病毒基因组转染HepG2细胞的培养上清中HBsAg表达水平基本相同 ,但 # 5 6毒株表达的HBeAg约为 # 2 18株的 3倍 ,Southern印迹及核酸杂交显示 ,# 5 6HBV株复制效率显著高于 # 2 18株 ,两株HBVDNA全长均为 32 15个核苷酸 ,同源性为 98 7% ,均为B基因型 (adw亚型 )。两者相差的42个核苷酸分布在C、Pre S1、Pre S2、P及X基因编码区 ,其中有位于SPⅠ、SPⅡ、Xp和ENHⅠ基因调控序列区中。 # 5 6患者感染的毒株基因组中Pre S2起始密码ATG变异为GTG ,但由Pre S1起始翻译形成的大蛋白中包括Pre S2的部分氨基酸 ,故 # 5 6血清和 # 5 6株转染细胞的培养上清仍可与Pre S2抗体出现阳性反应。

白介素-4和白介素-13促进人肺成纤维细胞ADAM33基因的表达

目的探讨白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)对人肺成纤维细胞ADAM33(a disintegrin and a metal-loproteinase33,ADAM33)mRNA表达的影响。方法以不同浓度的IL-4或/和IL-13刺激培养的人肺成纤维细胞(MRC-5),然后用实时定量反转录多聚酶链反应(real-time RT-PCR)法测定ADAM33mRNA表达的变化。结果人肺成纤维细胞上存在着ADAM33mRNA的表达,当分别以10ng/mL的IL-4或IL-13刺激时,AD-AM33mRNA的表达增加呈现时间依赖性,至24h达到高峰。随着IL-4和IL-13刺激浓度的增加,ADAM33mRNA的表达也明显增加:以100ng/mL的IL-4和100ng/mL的IL-13刺激时,ADAM33mRNA的表达较未刺激细胞分别增加了(9.49±2.83)倍和(14.21±3.35)倍(P<0.01);而以10ng/mL的IL-4和10ng/mL的IL-13联合刺激时,ADAM33mRNA的表达较未刺激细胞增加了(15.06±4.57)倍(P<0.01)。结论IL-4和IL-13能明显促进肺成纤维细胞ADAM33mRNA的表达。

柯萨奇B组病毒3型VPI基因疫苗免疫效果的研究

目的为研制防治病毒性心肌炎的基因疫苗打下基础。方法以带有CVB。P1、P2区核酸序列的pGEM质粒为模板，用PCR方法克隆CVB3VP1基因cDNA，插入真核表达载体pcDNA3中的HindⅢ和XbaⅠ位点之间，构建成重组质粒。经大量扩增纯化后，肌肉注射免疫BALB／c小鼠3次，用CVB3毒株攻击小鼠，取血及脾细胞检测其免疫效果。结果小鼠经3次免疫后，虽未测出明显免疫应答指标，但诱导了T、B细胞的免疫记忆反应，免疫组鼠在CVB3毒株攻击后，迅速诱导产生了强烈的二次免疫应答。结论CVB3VP1基因疫苗对CVB3毒株的攻击有一定程度的保护作用。