目的 利用巴斯德毕赤 (Pichia pastoris)酵母真核表达系统 ,构建真核表达载体 p PIC9K与人溶菌酶基因 (humanlysozyme,h L Y)的重组质粒 p PIC9K- h L Y,表达出具有活性的人溶菌酶 .方法 此项研究在本实验室构建的人溶菌酶(h L Y)基因...目的 利用巴斯德毕赤 (Pichia pastoris)酵母真核表达系统 ,构建真核表达载体 p PIC9K与人溶菌酶基因 (humanlysozyme,h L Y)的重组质粒 p PIC9K- h L Y,表达出具有活性的人溶菌酶 .方法 此项研究在本实验室构建的人溶菌酶(h L Y)基因与 p UC19的重组质粒 p UC19- h L Y的基础上 ,通过设计一对引物 ,用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出人溶菌酶全基因片段后 ,将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体p PIC9K中 ,构建重组质粒 p PIC9K- h L Y,经 Bg1 酶切线性化后 ,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内 .通过 G418筛选 ,选到的高拷贝转化子经 PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合 ,阳性克隆经甲醇诱导进行表达 .结果 序列测定 ,经 PCR扩增后的人溶菌酶基因与文献发表的序列相比 ,缺失 4个碱基 .我们决定采用重组 PCR法予以纠正 ,经序列测定结果正确 .用 PCR检测 ,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合 .用甲醇诱导表达并以 SDS- PAGE分析 ,在 Mr为 15 0 0 0左右出现一条蛋白带 ,表达量约占上清总蛋白的 0 .47.Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性 .用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表达产物具有人溶菌酶的活性 .结论 成功的构建了重组质粒 p PIC9K- h L展开更多
文摘目的 利用巴斯德毕赤 (Pichia pastoris)酵母真核表达系统 ,构建真核表达载体 p PIC9K与人溶菌酶基因 (humanlysozyme,h L Y)的重组质粒 p PIC9K- h L Y,表达出具有活性的人溶菌酶 .方法 此项研究在本实验室构建的人溶菌酶(h L Y)基因与 p UC19的重组质粒 p UC19- h L Y的基础上 ,通过设计一对引物 ,用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出人溶菌酶全基因片段后 ,将其克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体p PIC9K中 ,构建重组质粒 p PIC9K- h L Y,经 Bg1 酶切线性化后 ,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内 .通过 G418筛选 ,选到的高拷贝转化子经 PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合 ,阳性克隆经甲醇诱导进行表达 .结果 序列测定 ,经 PCR扩增后的人溶菌酶基因与文献发表的序列相比 ,缺失 4个碱基 .我们决定采用重组 PCR法予以纠正 ,经序列测定结果正确 .用 PCR检测 ,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合 .用甲醇诱导表达并以 SDS- PAGE分析 ,在 Mr为 15 0 0 0左右出现一条蛋白带 ,表达量约占上清总蛋白的 0 .47.Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性 .用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表达产物具有人溶菌酶的活性 .结论 成功的构建了重组质粒 p PIC9K- h L
