鸭RIG-1基因的PCR扩增及其序列分析

维甲酸诱导基因1(RIG-1)是细胞质中侦测病原相关分子模式的识别受体。论文旨在扩增北京鸭RIG-1编码基因,并对其进行序列分析。通过PCR方法,从北京鸭脾脏中扩增得到RIG-1基因cDNA,并使用LaserGene分子生物学分析软件进行序列分析。结果发现北京鸭的RIG-1基因cDNA开放阅读框全长2 802bp,编码933个氨基酸。结构预测发现鸭RIG-1结构与哺乳动物类似,N端有两个串联CARD区,中间为DExD/H解旋酶区,C端为抑制区,各功能区起重要作用的氨基酸较为保守。同源性及进化树分析发现鸭RIG-1与鹅和斑马鱼的同源性最高分别为93.7%、78.4%,与哺乳动物同源性高于50%,与其他鱼类的同源性低于50%。成功扩增出北京鸭RIG-1基因cDNA编码序列,为鸭RIG-1的深入研究奠定了基础。

禽流感病毒快速检测中的纳米磁珠分离器设计及试验

为实现禽流感病毒快速检测中的纳米级免疫磁珠分离,该文设计了一种便携式环形六孔纳米磁珠分离器,通过瓦型钕铁硼永磁体的合理布局,采用高导磁率的坡莫合金制作导磁片并贴合离心试管外壁锥度,实现了满足试验要求的6个局部强磁场区域,实测分离器分离空间磁感应强度达1166.2 mT,最大磁场梯度达152.7 T/m。为考核磁分离器分离效率,分别开展了多点磁感应强度测量、磁珠分离效率初步观察、透射电镜辅助观察等定性试验,并从定性和定量角度分别采用灭活的禽流感H5N1病毒和大肠杆菌E.coli O157:H7,结合Dot-ELISA和平板菌落计数方法进行了30、100和180 nm磁珠分离效率考核试验。试验结果表明:对于30、100和180 nm磁珠,当分离时间分别大于等于60min、60和40s时,磁珠分离器对3种磁珠捕获效率均在96.5%以上,分离上清液中均无残留磁珠,磁分离系统稳定可靠。

一株鸭源H3N6亚型禽流感病毒遗传进化分析

从活禽交易市场健康鸭体内分离到一株H3N6亚型禽流感病毒,命名为A/Duck/Guangdong/E9/2012(H3N6),这是该亚型禽流感病毒在我国广东地区的首次分离报道。为分析其遗传进化特征,对该病毒全基因组序列进行了测定,进行了遗传进化分析。结果显示,其HA裂解位点附近的氨基酸序列为PE-KQTR↓GLF,只含有1个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点氨基酸序列的分子特征;其HA基因与2011年蒙古国分离的鸭源A/Duck/Mongolia/OIE-7457/2011(H3N5)禽流感病毒的HA基因同源性最高,其NA基因与2011年蒙古国分离的鸭源A/Duck/Mongolia/OIE-7438/2011(H4N6)禽流感病毒的NA基因同源性最高。全基因组分子遗传进化分析结果显示,其8个基因均属于欧亚谱系的禽源进化分支。

H5亚型禽流感病毒多肽疫苗的初步研制

本试验利用生物软件对H5亚型禽流感病毒A/CK/GD/178/04的血凝素进行抗原特性分析,结合关于禽流感病毒血凝素抗原位点的文献报道,选定97～212位氨基酸和369～529位氨基酸两个区域作为多肽表位候选区域。利用本实验室自主研发的原核表达载体pBT载体,串联表达HA的两个区域,经SDS-PAGE和Western Blotting分析,证明重组产物得到表达,Ni2+柱纯化重组蛋白后,对2周龄SPF鸡进行免疫,经HI试验检测该重组蛋白可以刺激机体产生HI抗体。本研究为H5亚型AIV多肽疫苗的进一步研制奠定了基础。

广东省2015年人感染H7N9禽流感病毒基因特征分析

目的分析2015年广东省人感染H7N9禽流感病毒基因特征。方法对2015年1—12月送检广东省疾病预防控制中心的4份人感染H7N9禽流感病毒株进行病毒分离纯化并进行Ion Torrent高通量测序获得H7N9禽流感病毒全基因组8个基因片段。使用生物信息学软件将RNA序列与Gen Bank得到序列进行多重比对,并对病毒关键位点的分子变异情况进行分析,使用MEGA 7.0软件中最大似然法绘制遗传进化树进行基因进化分析。结果A/Guangdong/SZ17/2015(H7N9)、A/Guangdong/JM51/2015(H7N9)、A/Guangdong/ZH57/2015(H7N9)这3株人感染H7N9禽流感病毒的HA和NA基因与2014年广东省汕头、东莞等地的H7N9禽流感病毒进化距离最近,A/Guangdong/SW20/2015(H7N9)病毒的HA、NA基因与2014—2015年浙江温州、江苏淮安等地的H7N9禽流感病毒进化距离最近。ZH57病毒除NP基因与深圳H9N2亚型病毒高度同源(99.4%)以外,其余7个基因片段均与2013—2014年广东省内H7N9亚型禽流感毒株高度同源;其余3株病毒除HA和NA基因外,其余6个基因片段均与江西、安徽、江苏等地H9N2亚型病毒高度同源。分析相关致病位点得知,4株毒株中均出现可导致宿主特异性改变、病毒传播力、致病力、毒力及复制能力增强的位点突变,其中,4株病毒的HA蛋白受体结合区均发生G186V和Q226L这2个关键氨基酸位点的变异,对人呼吸道上皮细胞SAα-2,6Gal受体的结合能力增加,提示广东省H7N9禽流感病毒更容易感染人类。4株病毒的NA蛋白茎杆区69~73位氨基酸均出现缺失,这是禽流感病毒由野生水禽适应陆生家禽(鸡、鹌鹑等)的结果。4株病毒的M2蛋白均发生S31N突变,该突变会使流感病毒对M2离子通道抑制剂(金刚烷胺类药物)产生耐药性。所有毒株均保留了病毒对神经氨酸酶抑制剂的敏感性。结论 2015年广东省人感染H7N9病毒株具有遗传多样性及复杂性、致病力增强、对M2离子通道抑制剂的耐药性位点突变等趋势,存在对人和家禽宿主体内增殖及重配的可能性。

两株H6N2亚型鸡源禽流感病毒的分离鉴定

本研究利用血凝抑制试验(HI)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因测序等方法,对广东省某活禽交易市场进行流行病学调查时获得的两株非H5、H9亚型禽流感病毒65株和C7株进行了亚型鉴定。结果表明这两株病毒均具有血凝活性,且能被抗H6亚型禽流感病毒标准阳性血清特异性抑制。用针对禽流感病毒的M基因、H6亚型禽流感病毒HA基因、N2亚型禽流感病毒NA基因特异性鉴定引物对65株和C7株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段。测序及BLAST分析表明两株分离株与H6N2亚型禽流感广东分离株的HA基因和NA基因核苷酸序列相似性均高达95%以上。将该两分离株鉴定为H6N2亚型禽流感病毒,并命名为A/Chicken/Guangdong/65/2009、A/Chicken/Guangdong/C7/2009。

H6N6亚型禽流感病毒广东分离株分子遗传演化分析

2010年至2011年在中国广东地区活禽交易市场进行流行病学调查时,在鸭咽和泄殖腔拭子中分离到2株H6N6亚型禽流感病毒,分别命名为A/Duck/Guangdong/C45/2010(H6N6)、A/Duck/Guangdong/C120/2011(H6N6)。应用RT-PCR分别对2株毒株的8个基因片段进行了克隆、测序与分析,结果表明:2毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,只有1个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒HA裂解位点附近的氨基酸序列特征;与2毒株HA基因相似性最高的毒株为A/Duck/Guangxi/GXd-5/2010(H6N1),与NA基因相似性最高的毒株分别为A/Duck/Fujian/3242/2007(H6N6)和A/Duck/Fujian/6159/2007(H6N6)。全基因组分子遗传演化分析表明,2毒株的8个基因片段均属于欧亚谱系的禽源演化分支;但HA基因属于ST2853-like分支,NP基因属于HN573-like分支,PB2、PB1、PA、M和NS基因属于ST339-like分支,说明本研究中的2株病毒为不同基因群间基因交换的重组病毒。因此,有必要加强H6亚型禽流感病毒流行病学调查以便及时关注其遗传变异与致病性进化,为中国禽流感的预防与控制提供数据支持和理论指导。

呼吸道传染病病原识别新技术体系研究及在疫情防控中的应用

本项目为“十三五”国家科技重大专项课题“疫苗流行病学调查及免疫学评价”(2018ZX09739002-004);广东省科技计划课题“H7N9等多种禽流感病毒快速检测方法的建立及在外环境检测中的应用”(2013B020307006);广州市科技计划课题“14种呼吸道病毒阵列核酸实时荧光定量PCR检测”(2014J4100091)等7项课题的研究成果。项目开展期间,共获批国家课题经费2080万元。

七种新型冠状病毒候选标准株的筛选和评价

目的制备新型冠状病毒野生株(WT)、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1分支)等7株单克隆病毒株,用于申请国家标准株。方法利用蚀斑纯化技术感染Vero细胞后筛选单克隆毒株,通过观察细胞病变特性与病毒形态学特征、病毒滴度与全基因组序列测定、支原体检测等方法,以评价单克隆毒株的基础生物学特征。结果WT株、Beta变异株、Delta变异株、Omicron变异株(BA.2、BA.5、BQ.1和XBB.1)7株病毒感染细胞后,细胞病变表现为细胞圆缩脱落;蚀斑纯化后的病毒支原体检测均为阴性,2代至5代的病毒滴度在10^(5)~10^(8) TCID_(50)/ml之间;电镜下病毒颗粒呈圆形或者椭圆形,直径在60~140 nm之间;全基因组测序与系统进化分析明确了7种毒株的变异株类别,证实了单克隆毒株连续传代5代基因组特征稳定。结论制备7种代表性新型冠状病毒变异株的克隆株,具有典型冠状病毒细胞病变效应、形态结构清晰、病毒活性良好、遗传稳定等特性,可作为候选毒株用于申请国家标准株。

一种通用型肠道病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

目的建立一种肠道病毒通用型微滴式数字PCR(ddPCR)的定量检测方法,以实现肠道病毒的量化检测。方法利用肠道病毒标准品对ddPCR反应中的探针浓度、退火温度进行优化,并确定ddPCR本研究确定ddPCR的最佳探针浓度为0.4μmol/L,退火温度为51.0℃,核酸检测范围为3.02～3.59×106copies/μL,检出限为3.02 copies/μL。ddPCR结论本研究建立基于ddPCR肠道通用型的定量方法,可有效地对临床样本中不同血清型的肠道病毒临床样本进行拷贝数定量分析,为临床研究病毒载量的测定提供一种技术。

高通量测序H6N6亚型禽流感病毒及遗传进化分析

目的对2013年在广东地区活禽交易市场外环境中分离到的2株H6N6亚型禽流感病毒株进行全基因组测序和遗传进化分析,为广东地区外环境禽流感病毒监控提供实验数据。方法应用Ion Torrent对2份样本[A/Environment/Guangdong/SW-C12382070/2013(H6N6)和A/Environment/Guangdong/SW-C12382099/2013(H6N6)]进行高通量测序,然后采用分子生物学软件对测序结果进行序列分析。结果 BLAST结果显示,2株毒株血凝素蛋白(HA)基因裂解位点附近序列均为P-Q-I-E-T-R-G,仅含有1个碱性氨基酸,是典型的低致病性禽流感病毒特征序列。2株毒株的HA基因与越南分离株A/duck/Nha Trang/60/2013(H6N6)相似性最高,神经氨酸酶(NA)基因与湖南分离株A/chicken/Hunan/S4495/2010(H6N6)相似性最高。全基因组序列遗传进化分析结果显示,2株毒株的8个基因片段均属于欧亚谱系的禽源进化分支,其中HA基因属于ST2853-like分支,NA基因属于ST192-like分支,核蛋白(NP)基因属于HN573-like分支,碱性聚合酶2(PB2)、碱性聚合酶1(PB1)、酸性聚合酶(PA)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)基因属于ST339-like分支。结论本研究中的2株H6N6亚型禽流感病毒株为同一亚型不同基因群间基因交换的重组病毒。

人源抗寨卡病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

目的 利用噬菌体表面展示技术进行人源抗寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)噬菌体抗体库的构建及其基因工程单克隆抗体Fab段基因的获得和表达,掌握人源噬菌体抗体库的制备和针对特定病毒高度特异性的抗体筛选方法。方法 收集寨卡病毒病康复期患者的全血样本,分离淋巴细胞,采用RT-PCR方法成功地从淋巴细胞Ig mRNA中扩增出抗体轻链和重链Fab段基因,利用pComb3H系统成功构建具有基因多样性的人源抗ZIKV噬菌体抗体库制备。利用已纯化的ZIKV和已获得的ZIKV E蛋白抗原对已建立的抗体库进行富集筛选。结果 本研究成功地构建人源抗ZIKV噬菌体抗体库,并获得针对ZIKV E蛋白抗原的单克隆抗体Fab段基因,该基因能在大肠埃希菌中进行有效表达。结论 根据其序列分析研究表明,该单抗为一株新的抗ZIKV的人源基因工程抗体,这对建立ZIKV快速特异的早期诊断方法,获得特异性ZIKV人源治疗单抗奠定基础。

H9N2亚型禽流感病毒广东分离株的全基因克隆及序列分析

本研究以一株2006年广东省分离的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/HL/2006(H9N2)(简称Ck/GD/HL/06)为研究对象,用RT-PCR法扩增病毒基因组各片段(包括5′端和3′端的非编码区序列),将扩增片段进行克隆、测序并与参考毒株的相应序列进行比较分析,绘制各基因片段的系统发生树。分析结果表明,Ck/GD/HL/06株的HA基因同1997年中国香港鸭源毒株Dk/HK/Y280/97(H9N2)在同一进化分支,从HA的糖基化位点、受体结合位点等综合分析,该毒株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9亚型禽流感病毒的特点。HA的226位氨基酸残基为亮氨酸(Leu),具有同哺乳动物SAα,2-6受体结合的特性。Ck/GD/HL/06的PB1、PA和NP基因,同2004年越南分离的人源高致病性H5N1亚型流感病毒A/VietNam/1203/2004(H5N1)株(简写A/VN/1203/04)的核苷酸序列一致性分别是93.8%、95%和96.8%,在先前的研究中未见有类似特性毒株的报道,而这种特性H9N2亚型AIV的出现,是否会增加在重组过程中产生新的高致病性H5N1亚型AIV的可能性,是值得我们关注的一个问题,也提醒在我国华南地区应更加重视防控H9N2亚型AIV,做好长期对H9N2亚型AIV监控及分子流行病学调查的工作。

广州市2014—2015年严重急性呼吸道感染病例的流感病毒流行特征分析

目的了解广州市严重急性呼吸道感染(SARI)病例的流感流行特征。方法2014―2015年采集广州市监测点医院SARI病例的呼吸道样本,进行A型和B型流感病毒通用引物核酸检测。结果 2014―2015年共监测3 822例SARI病例,检出流感病毒核酸阳性951例,总阳性率为24.88%。其中A(H1N1pdm)阳性414例,阳性率为10.83%;A(H3)阳性378例,阳性率为9.89%;B型阳性121例,阳性率为3.17%;H5N6亚型禽流感病毒核酸阳性1例,阳性率为0.03%;H7N9亚型禽流感病毒核酸阳性37例,阳性率为0.97%。2014年SARI病例的流感流行高峰出现在上半年,以A(H1N1pdm)流行为主,2015年SARI病例的流感流行高峰出现在6―7月,以A(H3)流行为主。H7N9、H5N6禽流感感染的SARI病例主要集中在冬春季节。结论 2014―2015年广州市SARI病例流感病毒阳性检出率较高,以A(H1N1pdm)和A(H3)型流感病毒流行为主,今后应加强对SARI病例流感病毒的监测。

我国中东部地区诺如病毒GⅠ.1和GⅡ.4型人群血清抗体水平研究

目的研究我国人群中诺如病毒(norovirus,NoV)GⅠ.1和GⅡ.4型特异性IgG、IgA和组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)阻断抗体水平,从血清学角度认识我国诺如病毒流行情况,为疫苗研发、临床实验和疫苗免疫策略的设计提供数据参考。方法采用间接ELISA法和HBGA受体阻断试验,对采集自广州、襄阳和烟台的839份自然人群(年龄跨度为6月龄至88周岁)血清中NoV特异性IgG、IgA和HBGA阻断抗体进行检测并对检测结果进行统计学分析。结果人群NoV GⅠ.1和GⅡ.4型特异性IgG抗体总阳性率为91.9%和93.0%,IgA抗体总阳性率为48.6%和75.6%,HBGA阻断抗体效价分别为5.04(95%置信区间:4.63~5.49)和18.15(95%置信区间:16.11~20.44)。IgG和IgA抗体阳性率均随年龄呈上升趋势。各年龄组GⅠ.1和GⅡ.4特异性IgG抗体阳性率范围分别为79.2%~100.0%和76.7%~100.0%,其中0.5~<1岁为81.7%和85.0%,1~<2岁为79.2%和76.7%,至12~<18岁增加至98.1%和96.3%,其后分别维持在96%和98%以上。各年龄组GⅠ.1特异性IgA抗体阳性率范围为11.7%~93.8%,其中0.5~<1岁为11.7%,随年龄增加快速上升,至45~<60岁和≥60岁达到93.3%和93.8%;GⅡ.4型特异性IgA抗体阳性率范围为50.8%~88.8%,其中0.5~<1岁为50.8%,12~<18岁开始达到并保持在86.7%~90.7%。GⅠ.1型HBGA阻断抗体效价总体呈随年龄上升趋势,其中0.5~<12岁各年龄组抗体效价显著低于18岁及以上各年龄组(GMT:2.98~4.07 vs 8.21~11.62,P<0.001),12~<18岁年龄组抗体效价显著低于45岁及以上各年龄组(GMT:5.21 vs 11.03~11.62,P<0.05),差异均有统计学意义;GⅡ.4型HBGA阻断抗体效价未见明显的随年龄变化趋势,仅在2~<5岁和22~<45岁人群间具有统计学差异(GMT:26.73 vs 11.87,P<0.01)。结论获得了我国中东部地区人群血清中NoV GⅠ.1和GⅡ.4型特异性IgG、IgA和HBGA阻断抗体数据,揭示了其在不同年龄组的分布规律,为我国NoV疫苗的研发提供了初步的血清流行病学资料。

新型冠状病毒抗体水平检测方法的比较

目的分析新型冠状病毒抗体水平不同检测方法间的相关性和一致性。方法将重组新型冠状病毒疫苗免疫Wistar大鼠,采用ELISA法检测大鼠血清特异性IgG抗体水平,假病毒中和试验和野病毒中和试验检测大鼠血清中和抗体水平。对不同方法的检测结果进行相关性(Spearman秩相关)和一致性(kappa检验)分析。结果3种方法的检测结果均具有良好的相关性(Spearman rs>0.75,P<0.05)和一致性(kappa>0.75)。结论新型冠状病毒抗体水平3种检测方法结果的相关性和一致性均良好,对疫苗早期研发中免疫效果的评价具有重要指导意义。

登革病毒RdRp配体寡肽潜在广谱靶向作用研究

目的登革病毒(dengue virus,DENV)的NS5蛋白主要起RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)作用,本研究旨在通过构象型噬菌体展示肽库筛选潜在的抗病毒前体药物。方法以可溶性重组DENV-2 NS5蛋白为靶点,从构象型噬菌体展示肽库中筛选高特异性寡肽(oligopeptide,OP),并通过分子对接技术验证OP与RdRp之间的相互作用。将感染DENV-2的C6/36细胞暴露于不同浓度的OP中,并通过RT-qPCR检测病毒滴度,以此来评估OP的抗DENV-2作用。同时,将C6/36细胞暴露在较高浓度的OP中进行培养,并通过CCK-8法测定细胞活性以评估OP的细胞毒性。结果通过分子对接发现,OP可特异性结合于DENV NS5蛋白的RdRp结构域。在体外实验中发现,OP可以抑制DENV复制,且在细胞实验中未表现出细胞毒性。此外,基于RdRp结构域在单股正义链RNA(+ssRNA)病毒中的高度保守性,并利用分子对接技术初步发现,OP可能同样结合于多种+ssRNA病毒的RdRp活性空腔。结论OP可能具有广谱的+ssRNA病毒RdRp抑制能力,是一个潜在的广谱抗病毒前体药物。