肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的表达

为探讨一株肝细胞癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因在大肠杆菌中的可溶性表达策略并比较二者对抗原的结合能力,在三种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究,表达产物均以包涵体形式存在;对复性后的单链抗体以细胞ELISA及竞争抑制流式细胞仪法进行检测,表明人源化单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是:在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDR的天然构象。

恶性疟原虫多抗原表位基因的融合与表达

以霍乱毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）基因为载体，构建了含不同抗原表位的恶性疟原虫的融合基因ＣＴＢ／ＡＴＥ和ＣＴＢ／ＡＷＴＥ。前者除含有恶性疟原虫裂殖子表面主要抗原表位杂合多肽基因ＳＰｆ６６外，还含有很强的Ｔ辅助细胞表位ＣＳＴ３和Ｔｃ细胞表位；后者在此基础上将我国发现的Ｂ细胞表位ＮＫＮＤＤ基因经８次串联后融合其中。两种形式的融合基因经测序正确后转入大肠杆菌ＴＫ１０４６中，产量分别为１０ｍｇ／Ｌ及５ｍｇ／Ｌ。表达产物ＣＴＢ／ＡＷＴＥ经亲和层析纯化双抗夹心ＥＬＩＳＡ测定表明，该融合蛋白在保留了与抗ＣＴＢ抗体结合的同时，与抗ＮＫＮＤＤ单抗的结合效价达１：８０００。

鼠单克隆抗体人源化

鼠源性单克隆抗体应用于临床由于ＨＡＭＡ反应的存在而受到阻碍。以ＣＤＲ移植为核心，以同源分析及分子模建为辅助设计的人源化方案，已成为克服ＨＡＭＡ反应的主要手段。

恶性疟原虫多抗原表位基因的融合与表达

本研究以霍乱毒素B亚基(CT-B)基因为载体,构建了含不同抗原表位的恶性疟原虫的融合基因CTB/ATE和CTB/AWTE。前者除含有恶性疟原虫裂殖子表面主要抗原表位杂合多肽基因SPf66外,还含有很强的T辅助细胞表位CST3和Tc细胞表位;后者在此基础上将我国发现的B细胞表位NKNDD基因经8次串联后融合其中、两种形式的融合基因经测序正确后转入大肠杆菌TK1046中,产量分别为10mg/L及5mg/L。表达产物CTB/AWTE经亲和层析纯化的双抗夹心ELISA测定表明,该融合蛋白在保留了与抗CTB抗体结合的同时,与抗NKNDD单抗的结合效价达1∶8000。

鼠源单克隆抗体HAb25可变区的CDR-移植法人源化计算机辅助设计

目前鼠源抗体人源化是克服其免疫原性的主要手段。在结构模建基础上的计算机分析为抗体人源化设计提供了必不可少的辅助。本设计首先对肝细胞癌特异性抗体HAb25可变区进行了同源模建,然后分析决定CDR初始构象的可能残基,包括正则结构关键残基、CDR可接触残基、界面残基、包埋残基,以及与免疫识别密切相关的表面残基,综合考虑并结合多重序列比较,参照人源化模板,提出了人源化替代的方案。

肿瘤疫苗研究进展

根据经典的免疫学理论,将致病原(全细胞或抗原分子)免疫机体就能调动机体的特异免疫识别和免疫保护。瘤苗主动免疫是以肿瘤细胞、相关抗原、肿瘤特异抗原或模拟抗原、抗原编码基因免疫机体使之产生针对肿瘤细胞的主动性特异性免疫治疗策略。本文综述了以上不同层次的肿瘤疫苗在近年的研制进展。

恶性疟原虫无性期疫苗研究及进展

疟疾是威胁人类健康和生命的主要寄生虫疾病之一。近年来在世界上尤其是落后及发展中国家有卷土重来之势。恶性疟原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）是这类寄生虫中危害最大的病原体。它感染力强，增殖迅速，症状严重，初次感染者致死率高，是医务工作者和疫苗研究人员的主要征服目标［１］。世界各地的科技工作者为此付出了不懈的努力。本文拟对近几年来恶性疟原虫疫苗的研究作一综述。

鼠单克隆抗体人源化

鼠源性单克隆抗体应用于临床由于HAMA反应的存在而受到阻碍。以CDR移植为核心,以同源分析及分子模建为辅助设计的人源化方案已成为克服HAMA反应的主要手段。本文结合单抗人源化的最新进展对该领域的工作作一综述。

肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的克隆与表达

为探讨肝癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因的表达策略并比较二者的结合能力,在3种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究;对复性后的单链抗体以抗原捕获ELISA法进行检测。结果表明,在3种载体中表达的鼠源及人源化单链抗体都是包含体,诱导物浓度及培养温度不影响表达形式;抗原捕获细胞ELISA表明人源化的单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是:在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDRs的天然构象,表达的人源化单链抗体提供了免疫原性评价及临床应用的基础。

细胞内PCR法克隆抗体可变区基因

报道一种克隆免疫脾细胞中抗体可变区基因的新方法。抗原免疫小鼠的脾细胞经分散、固定、渗透处理 ,直接在细胞内进行反转录 ,再采用半巢式PCR扩增 ,获得的序列经测序证明是抗体可变区编码序列。这种不经mRNA纯化、从细胞内直接获取目的基因的方法既可用于抗体库的建立 ,亦可用于新基因的快速克隆。

单克隆抗体与肝癌免疫治疗

可用特异性单克隆抗体检测的人肝细胞癌的相关蛋白在早期诊断上有重要意义;基于抗体的生物治疗(尤其是免疫治疗)有多种途径,有些方法前景看好。免疫治疗中存在的问题有待进一步克服,应用于临床也必须和其他手段相结合。

p53选择性抗瘤腺病毒

多种肿瘤的抑癌基因p53发生了突变。一种腺病毒E1B缺失体ONYX-015能够在p53突变的肿瘤细胞内有效地复制而导致痛细胞的裂解,但不能在p53正常的细胞内复制。这种p53选择性抗瘤病毒代表了一类新的抗癌武器:溶癌病毒。

血管内皮生长因子特异性鼠源单链抗体的人源化

以抗体阻断血管生成信号来治疗实体肿瘤显示了很好的前景 ,但鼠源抗体首先必须经人源化改造以降低其免疫原性才能应用于人体。本研究以同源模建预测了一株人血管内皮生长因子 (VEGF)特异性鼠源单链抗体E11的三维结构 ,以结构数据为基础并采取单个最相似框架区替代法对其进行人源化设计 ;合成并组装了人源化单链抗体基因并在大肠杆菌中表达 ,包含体形式的产物以凝胶柱色谱法复性 ,经ELISA检测表明 ,人源化后的单链抗体保持了与天然VEGF结合的活性 ,表明采取的人源化路线具有可行性。

抗肝癌单链抗体的活性检测

将抗肝癌单克隆抗体 ＨＡｂ２５的轻、重链可变区基因通过Ｌｉｎｋｅｒ连接起来，构建成抗肝癌单链抗体ｓｃＦｖ２５，然后亚克隆入含 Ｅ－ｔａｇ检测标签的 ｐＥＴ１５ｂ表达载体进行融合表达。表达产物（ｓｃＦｖ２５－Ｅ－ｔａｇ）采用 ＳＡＢＣ法对肝癌细胞涂片进行染色，利用鼠抗Ｅ－ｔａｇ抗体间接检测初步纯化的ｓｃＦｖ２５的活性，同时采用竞争结合实验检测ｓｃＦｖ２５的亲和活性。ｓｃＦｖ２５能够与靶细胞特异性结合，阳性部位主要定位于细胞膜上；ｓｃＦｖ２５可封闭５３％的亲本抗体的亲和活性。ｓｃＦｖ２５较好地保持了亲本抗体的特异性和亲和活性。

抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建、表达及活性鉴定

鼠单克隆抗体E11能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合,已用于临床检测恶性肿瘤细胞VEGF的表达,并初步证明其体内抑瘤活性。为便于大规模生产,特进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体(scFv)。首先通过逆转录及多聚酶链式反应(PCR),分离并克隆E11的可变区基因。经测序表明,E11轻链可变区(VL)基因全长333bp,编码111个氨基酸,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。重链可变区VH基因全长369bp,编码123个氨基酸,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。然后用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接,构建表达质粒pET-15YV,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物(包含体)经变性及复性后,用免疫组化法检测该单链抗体结合抗原(颊癌)能力。对颊癌组织检测的结果表明,基因工程抗体scFv与亲代抗体一样,具有较高的组织特异性。本研究获得的抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床价值,为肿瘤放射免疫显像及以血管为靶标的抗血管生成治疗奠定了基础。

霍乱毒素B亚基与疟原虫多价抗原的融合、表达及免疫原性研究

疟疾是严重威胁人类身体健康的疾病,全世界每年有300万人死于疟疾,因此研究有效的疟疾疫苗具有重要意义。但是由于疟原虫生活史十分复杂,给人疟疾疫苗研究带来了很大困难。一度呼声颇高的Spf66疫苗在大量的人体试验结果表明其保护效率低,其主要原因可能是Spf66为小肽,其免疫原性不强,因此使用合适的佐剂是提高疟疾疫苗免疫原性和保护效率的途径。美国Water Reed陆军医学研究所应用乙肝表面抗原为佐剂,研制的疟疾疫苗显著提高了保护效果。 霍乱毒素是良好的疫苗载体和免疫佐剂。

小鼠单克隆抗体HAb25可变区的人源化计算机辅助设计

目的：对一株肝癌特异性小鼠单克隆抗体ＨＡｂ２５可变区进行人源化设计，通过人源化降低其免疫原性。方法：进行抗体结构同源模建，以计算机分析为主要手段，结合多重序列比较，进行人源化设计。结果：预测了ＨＡｂ２５可变区的立体结构，分析了决定抗体互补决定区初始构象的可能残基，提出了ＨＡｂ２５可变区的人源化替代方案。

抗人血管内皮生长因子单链抗体的构建和表达及其活性鉴定

目的 对能与人血管内皮生长因子 (VEGF)特异结合 ,并对体内有抑瘤活性的单克隆抗体 (E11)进行基因工程改造 ,构建小分子的单链抗体 (ScFv) ,为临床应用奠定基础。方法 通过逆转录及多聚酶链式反应 ,扩增并克隆E11的可变区基因片段。用一编码亲水性多肽接头的DNA片段将E11轻、重链可变区基因连接 ,构建表达载体PET 15YV ,并导入大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达。表达产物经变性及复性后 ,用免疫组化方法检测其活性。结果 经测序表明 ,VL基因全长 333bp ,编码111个氨基酸 ,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。VH基因全长 36 9bp ,编码 12 3个氨基酸 ,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ (A)亚组。对颊癌组织进行检测的结果表明 ,基因工程抗体ScFv与原代抗体一样 ,具有较高的组织特异性。结论 抗人血管内皮生长因子单链抗体可作为生物导向药物 。

抗肝癌人源化单链抗体融合肿瘤坏死因子α的导向作用

目的：获得有临床应用潜力的人源化抗肝癌基因工程双功能抗体。方法：将鼠源性抗肝癌单克隆抗体HAb25的人源化单链抗体（hscFv25）基因与人TNF(基因偶连构建抗肝癌双功能抗体（hscFv25-TNFα），亚克隆入原核GST融合表达载体pGEX 4T-1中，在大肠杆菌中进行表达并纯化目的蛋白。对肝癌SMMC-7721细胞涂片进行间接免疫荧光染色测定纯化后的基因重组双功能抗体蛋白活性。MTT实验测定hscFv25-TNFα对靶细胞SMMC-7721杀伤活性。荷肝癌(SMMC-7721)裸鼠体内的初步抑瘤实验检测hscFv25-TNFα的导向治疗效果。结果：hscFv25-TNFα具有与亲本抗体HAb25相同的抗原结合特异性。1h预处理的MTT实验显示，hscFv25-TNFα对靶细胞SMMC-7721具有明确的杀伤作用，其IC50值为7.1mg/L，且该杀伤作用可被亲本抗体HAb25所封闭，表明hscFv25-TNFα对靶细胞的杀伤作用是抗体hscFv25介导的选择性杀伤作用。hscFv25-TNFα对荷肝癌裸鼠体内直径3.0mm左右的肿瘤具有明确的导向杀伤作用,有效率达到3/3，1/3完全缓解，强于TNFα对照组，该组有效者只有2/3，同时无完全缓解。结论：hscFv25-TNFα是具有一定临床应用潜力的抗肝癌双功能抗体。