敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖

细胞骨架肌动蛋白在细胞增殖、迁移等生物学过程中发挥重要作用,然而WDR1作为肌动蛋白解聚的主要辅助因子,其在平滑肌细胞中的作用尚无报道。构建Wdr1条件性诱导敲除小鼠模型,进而分离小鼠原代主动脉平滑肌细胞,诱导敲除Wdr1,检测平滑肌细胞的形态、增殖和迁移情况。PCR结果显示,Wdr1f/f;ERT2Cre小鼠模型构建成功。免疫荧光结果表明:在前人基础上改进的分离方法能够高效分离原代平滑肌细胞。细胞形态观察结果显示:Wdr1敲除后对细胞的形态有显著性影响。同时,划痕实验以及CCK8检测结果也表明:Wdr1的条件性诱导性敲除可明显抑制平滑肌细胞的迁移和增殖。Wdr1敲除后平滑肌细胞的形态以及细胞生物学过程的改变提示其与血管疾病的发生和发展有紧密联系,这对揭示血管病理生理过程有重要意义。

EDU脉冲追踪小鼠心脏第二心场细胞迁移方法的优化

流出道(Outflow tract,OFT)发育畸形约占出生时检测到的人类先天性心脏病的30%,OFT和右室是由第二心场(Second heart field,SHF)祖细胞发育形成。SHF祖细胞向心管部署、迁移使心管得以足够的伸展,是心脏形态发生所必需的。然而,迄今SHF发育及迁移部署过程仍不清楚。建立标记、追踪小鼠心脏第二心场细胞迁移的方法,对于阐明哺乳动物心脏SHF迁移、部署的细胞生物学过程具有重要意义。首先采用文献报道的EDU(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)脉冲追踪方法及剂量(10mg/kg),发现大部分胚胎并不能被EDU标记。接下来,分别对EDU标记的剂量以及脉冲标记的时间进行优化,分析EDU在SHF细胞中的标记情况、EDU标记的SHF细胞向OFT的迁移情况。发现EDU剂量增加到40 mg/kg能对胚胎进行有效的标记(由6只孕鼠获得的31只胚胎均被有效的标记),且不会对孕鼠和胚胎造成毒性;EDU脉冲标记2 h和4 h,EDU在SHF细胞中的标记效率、EDU标记SHF细胞迁移进入远端OFT的距离均没有差异。研究表明使用40 mg/kg的EDU脉冲剂量和2 h的标记时间,可对胚胎的SHF细胞进行有效的标记,经过19 h的追踪,EDU标记的细胞能够迁移进入到远端OFT中。

肌动蛋白细胞骨架在小鼠第二生心区祖细胞部署发育中的作用

脊椎动物心管起源于早期胚胎的生心中胚层细胞,随后从邻近的咽中胚层和内脏中胚层中逐渐添加第二生心区(second heart field, SHF)祖细胞而延长。SHF细胞向心管贡献受损,使心管不能最大限度地延长,导致一系列的心脏发育缺陷,包括最常见的右心室发育不良与流出道分隔旋转异常等先天性出生缺陷。SHF祖细胞构成非经典顶端-基底极性上皮,并具有顶部单纤毛、动态肌动蛋白(actin)富集基底端的丝状伪足等特点。本文总结了actin细胞骨架在小鼠SHF祖细胞部署发育过程中的研究进展,揭示actin细胞骨架在SHF祖细胞发育特别是SHF细胞向流出道部署过程中的重要性,以期为阐明和理解SHF祖细胞迁移、部署的细胞生物学特性提供一定的理论参考。

小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化

[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。