噪声引起小型猪耳蜗炎症复合体的激活及蛋白质组学研究

目的通过研究炎症复合体及相关通路在猪耳蜗中的激活,探讨噪声介导炎症复合体激活的关键分子机制,为噪声性耳聋的预防和治疗提供新靶点。方法采用小型猪为研究对象,建立噪声性耳聋模型,测试噪声暴露前后动物的ABR阈值,应用蛋白质组学iTRAQ、生物信息学、western blot、荧光实时定量PCR等技术,研究噪声刺激引起耳蜗炎症复合体的激活以及作用机制。结果正常小型猪ABR阈值为35.4±2.6 dB SPL,噪声后一天ABR阈值平均提高到72.1±4.1dB SPL,在4k Hz处听力损失最严重,高频听力损失较低频严重;噪声后七天平均ABR阈值恢复至52.8±4.7dB SPL,4k Hz以上听力恢复较低频稍差。iTRAQ实验共鉴定到蛋白质2158种,噪声暴露后较正常组具有显著差异表达的蛋白质共227个,富集在免疫过程的差异表达蛋白包括:ASC, caspase-1, IL-1 beta,CD59等。富集的KEGG pathway包括:阿尔兹海默病信号通路,帕金森病信号通路,MAPK信号通路,,氧化磷酸化通路等。结论噪声暴露后可能激活耳蜗内NLRP3受体介导的炎症复合体,通过caspase-1活化IL-1β、IL-18,并间接促进TNF-α等炎症因子上调,加剧耳蜗内炎症反应,导致耳蜗内重要结构的损伤,这一机制可能是噪声引起听力损失的重要原因。

荣昌猪电子耳蜗植入方法建立及听功能初步观察

目的 建立在大型哺乳动物-猪体内植入电子耳蜗的方法,观察电子耳蜗植入前后听功能变化。方法 荣昌猪6只,雌雄不限,40-45日龄,体重8～12Kg,均选自重庆畜牧科学院养猪研究所。分为听力正常组（Mitf＋/＋）,与突变耳聋组（Mitf-/-）,每组3只。在全麻下进行电子耳蜗植入术。于手术前,手术后即刻以及手术后1周记录听性脑干反应（Auditory Brainstem Response,ABR）,和电刺激脑干诱发电位（Electrical Auditory Brainstem Response,EABR）;头颅X片观察电极植入位置。结果 6只动物电子耳蜗植入手术成功,耳蜗电极位置正确,在耳蜗内盘绕1.5～1.75圈。电子耳蜗植入即刻,手术侧（右耳）各频率ABR阈值在120 dB SPL无法引出;手术后7天,手术侧（右耳）,低频ABR阈值在100dB SPL左右,高频在120 dB SPL仍无法引出。听力正常荣昌猪组（Mitf＋/＋）,电子耳蜗植入手术即刻及一周后EABR阈值在90CL左右,明显低于突变耳聋荣昌猪组（Mitf-/-）的190CL。结论 本研究建立的荣昌猪电子耳蜗植入方法 确实可行,通过植入电极进行EABR测试方法 设计合理。为更加直接地研究电子耳蜗植入设备在体内的工作状态和各项数据,研究电极植入后耳蜗的生理病理改变创造了条件。

猪脂肪间充质干细胞的原代培养及诱导鉴定

目的：原代培养猪脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cell，ADMSC），探索其适宜培养温度并对其进行诱导鉴定。方法采用胶原酶消化法原代分离培养猪脂肪间充质干细胞，用WST-1法比较猪ADMSC在37℃和38℃条件下的生长曲线，向成骨、成脂和成软骨方向诱导分化ADMSC，鉴定其多能性。结果用胶原酶消化法可以从猪颈部脂肪组织中分离培养出脂肪间充质干细胞，贴壁生长，P2代以后形态均一，稳定增殖，约5天可传代，在一定条件诱导下可以向成骨、成脂或成软骨方向分化，适宜在5%CO2、38℃、饱和湿度条件下培养。结论原代培养的猪脂肪间充质干细胞分离方便、增殖速度快、状态稳定，具有多向分化潜能，是可靠的供体细胞来源。

小型猪与大鼠不同记录部位诱发VEMP的比较

目的分析正常小型猪不同记录部位(颈部伸肌、咬肌)的前庭诱发肌源性电位(vestibular evoked myogenic potential,VEMP)波形图,并与大鼠的VEMP波形图进行比较;方法各选取12只前庭功能正常的大鼠和小型猪,进行麻醉之后,用自制装置进行固定,1000Hz强短声诱发颈部伸肌、咬肌肌源性电位,并记录其波形;结果大鼠颈部伸肌诱发的肌源性电位,第一个正向波P的潜伏期为6.45±0.23ms,振幅约1.45±0.49uv,80dB SPL引出率为58%;咬肌诱发肌源性电位,第一个正向波P的潜伏期为6.38±0.34ms,振幅约1.57±0.35uv,阈值80dB SPL引出率为50%。小型猪颈部伸肌诱发肌源性电位,第一个正向波P的潜伏期7.65±0.64ms,振幅1.66±0.34uv,80dBSPL的引出率为58%;咬肌诱发肌源性电位,第一个正向波P的潜伏期7.60±0.78ms,振幅1.31±0.28uv,80dBSPL的引出率为50%。结论小型猪和大鼠不同部位记录得到的VEMP,只有振幅和引出率的差异,而潜伏期没有统计学意义;从波形的重复性、波幅的大小、引出率以及潜伏期的综合考虑,小型猪咬肌部位记录的VEMP波形优于颈部伸肌,大鼠颈部伸肌记录得到的VEMP波形优于咬肌;在相同部位记录到VEMP第一个正向P波的潜伏期时间、波幅的大小方面小型猪较大鼠的稍高。

小型猪肌源性诱发前庭电位的检测

目的探索小型猪肌源性诱发前庭电位(Vestibular-evoked myogenic potential,VEMP)的最佳检测方法。方法选取正常成年的雌性小型巴马香猪,以3%戊巴比妥钠+速眠新Ⅱ进行麻醉之后,用自制装置进行固定,1000Hz强短声诱发颈部伸肌肌源性电位和咬肌肌源性电位,并记录其波形;结果颈部伸肌诱发肌源性电位,第一个正向波P的潜伏期7.65±0.64ms,振幅1.66±0.34uv,80dBSPL的引出率为75%;咬肌诱发肌源性电位,第一个正向波P的潜伏期7.60±0.78ms,振幅1.31±0.28uv,80dBSPL的引出率为66%。结论小型猪颈部伸肌和咬肌在强声下诱发的肌源性电位潜伏期和阈值均一致;颈部伸肌部位所记录到的VEMF波幅稍高于咬肌部位记录到波幅;但相比之下,咬肌位置表浅,便于定位,肌肉组织发达,肌紧张性强,更易于肌源性诱发电位的记录。

噪声损伤和苯扎贝特干预对豚鼠耳蜗脂肪酸转运蛋白1和4表达的影响

目的观察豚鼠耳蜗脂肪酸转运蛋白1和4(fatty acid transport protein,FATP1,FATP 4)在噪声损伤和促脂肪酸代谢药物苯扎贝特干预前后的变化,探讨噪声性听力损失与FATP1、FATP4的关系。方法正常听力健康成年雄性Dunkin Hartley豚鼠21只随机分为对照组(15只)和干预组(6只),对照组在噪声暴露前随机选取3只(6耳)动物行耳蜗取材作为正常对照组,其余12只(24耳)与干预组(6只,12耳)一起予以白噪声(110 dB SPL,每天4小时,连续12天)暴露,干预组在噪声暴露的同时给予苯扎贝特(5 mg·kg-1·d-1)灌胃干预;在开始噪声暴露第6、12、24天行听性脑干反应(ABR)检测,采用脂肪酸特异性探针荧光标记技术检测脂类物质在豚鼠耳蜗的分布,采用免疫荧光染色技术、Western blot技术检测噪声暴露前后FATP1、PATP4在两组豚鼠耳蜗的表达变化。结果噪声暴露后对照组和干预组click声及4、8、16 kHz短纯音(tone burst)ABR(tb-ABR)反应阈较噪声暴露前显著升高,在噪声暴露的第12天,干预组4 kHz tb-ABR反应阈(16.25±5.82 dB SPL)明显低于对照组(32.27±5.92 dB SPL)(P<0.05);特异性脂肪酸探针荧光染色提示正常对照组豚鼠耳蜗脂类物质主要分布于基底膜外侧的Hensen细胞、螺旋神经节、血管纹,噪声暴露前免疫荧光染色显示FATP1主要表达于Corti器、螺旋唇,在螺旋神经节细胞、螺旋韧带、血管纹等少量表达;FATP4主要表达于耳蜗Corti器及螺旋韧带,在Corti器外侧的Hensen细胞、螺旋神经节、血管纹极少表达或不表达。噪声暴露后对照组(第12天)FATP1在Corti器、Hensen细胞、螺旋突、螺旋韧带的表达较噪声暴露前明显增加(P<0.01),对照组(第12天)和干预组(第24天)FATP4在Hensen细胞、螺旋唇、螺旋神经节的表达均较噪声暴露前明显增加(P<0.01),干预组(第24天)FATP4在血管纹的表达均较噪声暴露前增加(P<0.05),但对照组(第12天)FATP4在血管纹的表达均较噪声暴露前及干预组(第24天)明显降低(P<0.05);Western blot结果则提示对照组和干预组FATP1和FATP4在全耳蜗的表达均较噪声暴露前增加(P<0.05)。结论噪声损伤可提高FATP1和FATP4在豚鼠耳蜗部分组织的表达水平,促进耳蜗内脂肪酸转运;促脂肪酸代谢药物(苯扎贝特)干预可进一步改变FATP4在耳蜗的表达分布,从而在一定程度上防止噪声性听力损失或促进噪声性听力损失恢复;提示耳蜗内脂肪酸代谢水平可能是改善噪声性听力损失的重要因素。

CMC-TAT蛋白转导肽纳米载体体外转染效果评估

目的构建羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体(CTNs),探究CTNs介导miR96转染293细胞和耳蜗基底膜的效率及安全性,为mi R96在内耳的功能研究奠定基础。方法应用羧甲基化的壳聚糖(CMC)与TAT蛋白转导肽合成CTNs,携带标记花青染料荧光(cy3)的mi R96模拟物(mi R96 mimics),转染293细胞和耳蜗基底膜,利用激光共聚焦荧光显微镜对293细胞和耳蜗基底膜铺片进行荧光阳性细胞计数,以阳离子脂质体作为对照,评价转染效率,采用MTT试验评价CTNs的安全性。结果成功制备了CTNs,纳米颗粒平均直径约186.6nm,粒径分布集中,无明显聚集现象;CTNs-mi R96-cy3转染293细胞的平均阳性细胞率为32.6%,转染耳蜗基底膜毛细胞的平均阳性细胞率为24.4%,均低于阳离子脂质体-mi R96-cy3;MTT试验示CTNs细胞毒性低于阳离子脂质体。结论 CTNs作为一种新型的纳米载体,可携带miR96成功转染耳蜗基底膜,提示了纳米载体作为miRNA载体的可行性,并且安全性较高,但转染效率不足。

新生豚鼠急性高胆红素血症模型的听性脑干反应特征

目的通过在新生3天豚鼠建立高胆红素血症模型，研究其听性脑干反应（ABR）的特征，探讨高胆红素血症对听觉系统损伤的部位。方法将新生3天的豚鼠73只随机分成对照组10只、低剂量组（75μg／g）40只和高剂量组（100μg／g）23只，分别腹腔注射生理盐水或胆红素溶液，给药前和给药后1h、4h、8h分别进行ABR的动态监测，测量各波潜伏期、波间期、阈值。在给药8h后心脏取血，测其血清总胆红素（total serum bilirubin,TSB）的量。结果对照组10只豚鼠注射生理盐水后，ABR各波潜伏期、波间期及阈值未见明显变化。低剂量组（40只）豚鼠注射胆红素溶液后，14只豚鼠ABR各波潜伏期、波间期均有延长，差异有统计学意义（P〈0．05），但阈值未见明显升高。高剂量组（23只）豚鼠注射胆红素溶液后，10只豚鼠ABR各波潜伏期、波间期均延长且阈值升高，差异有统计学意义（P〈0．05）。高剂量组较低剂量组各时间点ABR各波潜伏期、波间期延长更为明显，差异有统计学意义（P〈0．05）。给药8h后高剂量组血清TSB水平高于低剂量组、高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论高胆红素血症可以同时损伤外周和低位脑干听觉系统，ABR各波潜伏期、波间期的变化较ABR阈值更敏感，适用于早期发现高胆红素血症引起的听觉系统损伤。

mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs纳米载体体外安全性与有效性评估

目的:构建并获得mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs载蛋白复合物,评估mPEG-PLGA载体体外递送目的蛋白对Hela细胞的有效率及安全性,以筛选适用于内耳疾病治疗的理想的、具有缓释特性的多肽、蛋白质类药物递送载体材料。方法:应用mPEG化学修饰PLGA纳米材料作作为递送载体,携带标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的牛血清白蛋白(BSA),体外转导Hela细胞,选择不同的时间利用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞递送效率并对阳性细胞计数,计算评估递送有效率,采用MTT法检测不同时间点mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs载体复合物的体外细胞安全性。结果:mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs呈现经典纳米尺寸大小,包封率达到(51.2±2.3)%,且具有持续、缓慢释放的特性,在优化的体外递送条件下,mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs体外递送蛋白有效率最高达到了63.7%以上;同时,在mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs递送效率达到最佳的条件下,细胞安全性为85.7%。结论:mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs纳米复合物作为一种新型的、安全有效的纳米蛋白递送载体材料,能够成功携带靶向蛋白体外递送细胞,且具有缓慢释放特性,能够为未来应用纳米材料进行感音神经性聋的治疗提供良好的载体系统。