miR-21-5p靶向JAK/STAT信号通路抑制Th1细胞极化

目的探讨miR-21-5p对1型辅助性T细胞(Th1细胞)极化相关信号通路的调控作用。方法提取小鼠脾单个核细胞,用免疫磁珠阴性分选试剂盒分离初始(naive)CD4^(+)T细胞,用抗小鼠CD3ε,CD28和白细胞介素4(IL-4)单克隆抗体及小鼠IL-12和IL-2混合因子诱导体系诱导初始CD4^(+)T细胞向Th1细胞极化,同时转染miR-21-5p模拟物或模拟物对照,分别命名为Th1诱导组、诱导+模拟物对照组和诱导^(+)miR-21-5p模拟物组,72 h后用流式细胞术检测CD4和干扰素γ(IFN-γ)双阳性(CD4^(+)IFN-γ^(+))细胞百分比;用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Th1细胞极化相关关键转录因子和细胞因子mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化相关通路关键蛋白及其磷酸化水平。结合双荧光素酶报告系统验证miR-21-5p作用靶标关键细胞因子IFN-γ、信号通路受体IL-12受体β_(1)(IL-12Rβ_(1))和信号转录与转录激活因子1(STAT1)的表达。结果经免疫磁珠分选获得高表达CD62L的初始CD4^(+)T细胞。与Th1诱导组和诱导+模拟物对照组相比,诱导+miR-21-5p模拟物组CD4^(+)IFN-γ^(+)细胞百分比显著降低(P<0.01);Th1细胞极化相关Janus激酶(JAK)/STAT信号通路关键转录因子STAT1(P<0.01)、STAT4(P<0.05)和T盒21转录因子(T-bet)(P<0.01)mRNA表达显著下调,IFN-γ(P<0.01)和IL-12Rβ_(1)(P<0.05)mRNA表达水平亦显著下调,同时STAT1和STAT4蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.01)。结合双荧光素酶报告系统结果表明,miR-21-5p模拟物可分别特异性靶向结合IFN-γ(P<0.01),IL-12Rβ_(1)(P<0.01)和STAT1(P<0.05)基因的3′-非翻译区,而对应靶向位点突变后miR-21-5p模拟物不影响其表达。结论miR-21-5p可靶向下调IFN-γ,IL-12Rβ_(1)和STAT1表达,抑制IL-12和IFN-γ介导的JAK/STAT信号通路活化,从而抑制Th1细胞极化。

壳多糖酶3样蛋白1对人脐带来源间充质干细胞成脂和成骨分化的调控作用

目的探讨壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)对人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSC)成脂和成骨分化的调控作用。方法复苏并培养hUC-MSC,流式细胞术检测细胞表面标志物CD14,CD34,CD45,CD73,CD90和CD105;成脂和成骨诱导分化后,油红O染色和碱性磷酸酶(ALP)染色检测体外成脂和成骨分化能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测成脂和成骨关键转录因子mRNA表达,即脂肪酶(ADI)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)mRNA表达及ALP和骨桥蛋白(OPN)mRNA表达。利用慢病毒载体构建稳定敲低CHI3L1的hUC-MSC(shCHI3L1-MSC)和对照hUC-MSC(shNC-MSC),同上鉴定其生物学特征。shCHI3L1-MSC和shNC-MSC体外成脂诱导分化后,油红O染色检测细胞内脂滴数目,RT-qPCR检测ADI和PPAR-γmRNA表达;成骨诱导分化后,ALP染色检测ALP染色面积,RT-qPCR检测ALP和OPN mRNA表达。结果培养的hUC-MSC高表达CD73,CD90和CD105,低表达或不表达CD14,CD34和CD45;成骨诱导分化后,与未诱导组相比,诱导组ALP活性增加,ALP和OPN mRNA表达显著增加(P<0.01);成脂诱导分化后,经油红O染色,诱导组出现大量红色脂滴,ADI和PPAR-γmRNA表达显著增加(P<0.01)。敲低CHI3L1基因,hUC-MSC表面标志物、成脂和成骨分化能力生物学特性未发生改变。shNC-MSC和shCHI3L1-MSC成脂和成骨诱导分化后,shCHI3L1-MSC诱导组脂滴数及ADI和PPAR-γmRNA表达均显著高于shNC-MSC(P<0.01),ALP活性及ALP和OPN mRNA表达均显著低于shNC-MSC(P<0.01),提示hUC-MSC敲低CHI3L1基因后成脂分化能力增强,成骨分化能力降低。结论CHI3L1参与hUC-MSC体外成脂和成骨分化调控。

miR-148a-3p通过抑制IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路抑制Th1细胞极化

目的探讨miR-148a-3p调控1型辅助性T(Th1)细胞极化调控的分子机制。方法分离6周龄小鼠的脾单个核细胞,经免疫磁珠阴性分选获得初始CD4+(naïveCD4+)Th细胞,用流式细胞术测定naïve CD4+Th细胞CD62L表达水平。用小鼠白细胞介素12(IL-12)和IL-2及抗小鼠IL-4,CD28和CD3ε单克隆抗体的混合因子体外诱导naïveCD4+Th细胞向Th1细胞极化,同时在诱导体系中加入miR-148a-3p模拟物,诱导72 h。流式细胞术检测干扰素γ(IFN-γ)和CD4双阳性(IFN-γ+CD4+)细胞百分比,实时荧光定量PCR检测Th1细胞极化相关基因IFN-γ、信号转导与转录激活因子1(STAT1)、IL-12受体β_(1)(IL-12Rβ_(1))、IL-12Rβ_(2)、STAT4和T细胞介导的转录调节因子21(Tbx21)mRNA表达水平;Western印迹法检测Th1细胞极化关键转录因子STAT4和磷酸化STAT4(p⁃STAT4)蛋白表达水平。经生物信息学分析预测miR-148a-3p对IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路分子IL-12Rβ_(1),IL-12Rβ_(2),Tbx21和STAT4的调控靶标序列,用双荧光素酶载体psiCHECK2分别构建IL-12Rβ_(1),IL-12Rβ_(2),Tbx21和STAT4的3′UTR序列(psi-wt)及靶标点突变(psi-mutant)序列的克隆载体。将psi-wt和psi-mutant载体分别与miR-148a-3p模拟物共转染至人宫颈癌HeLa细胞,转染36 h后裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测。结果经免疫磁珠分选获得的naïveCD4+Th细胞高表达CD62L,表明naïveCD4+Th细胞分离成功;诱导后Th1细胞极化百分比为(71±5)%,miR-148a-3p模拟物转染后Th1细胞极化百分比下降至(61±3)%(P<0.05)。miR-148a-3p模拟物转染可下调Th1极化关键转录因子STAT1(P<0.01),Tbx21(P<0.01)和STAT4(P<0.01)mRNA表达水平,同时IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路的关键受体IL-12Rβ_(1)(P<0.05)和IL-12Rβ_(2)(P<0.01)及调控Th1极化关键细胞因子IFN-γ(P<0.01)mRNA表达水平亦显著下调。miR-148a-3p模拟物转染可显著下调Th1极化过程所必需的STAT4和p-STAT4蛋白表达水平。生物信息学预测miR-148a-3p靶标并用双荧光素酶报告载体构建含其psi-wt和psi-mutant序列的克隆载体;经双荧光素酶报告系统检测证实,miR-148a-3p可靶向下调IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路的多个关键分子STAT4(P<0.01),Tbx21(P<0.01),IL-12Rβ_(1)(P<0.01)和IL-12Rβ_(2)(P<0.01)表达。结论miR-148a-3p通过靶向抑制IL-12/IL-12Rβ_(1)/IL-12Rβ_(2)/IFN-γ通路中STAT4,Tbx21,IL-12Rβ_(1)和IL-12Rβ_(2)蛋白表达抑制Th1细胞极化。

间充质干细胞治疗炎性疾病的研究进展

间充质干细胞(MSC)是具有低免疫原性和强大免疫调节特性的成体干细胞,在平衡体内的免疫紊乱和减轻炎症状态中发挥重要作用,被广泛用于炎性疾病的研究和治疗。MSC通过调控辅助性T细胞1(Th1)、Th17和调节性T细胞亚群的分化及相关炎症因子的分泌,降低移植物抗宿主病和类风湿性关节炎的炎症反应;通过促进胰岛再生、抑制胰岛素抵抗和调节肝糖原的新陈代谢等,治疗由自身免疫反应引起的胰岛素缺陷的1型糖尿病和由胰岛素抵抗引起的2型糖尿病;通过抑制滤泡辅助性T细胞增殖、B细胞分化和抗体产生,促进调节性B细胞增殖和抑炎因子的分泌。另外,MSC还可有效治疗系统性红斑狼疮。因此,以MSC为主的细胞治疗有望成为替代传统治疗的新方式。本文就MSC的免疫调节特性及其在炎性相关疾病方面的研究进展进行综述。

高表达miR-25-3p对小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的抑制作用

目的探究miR-25-3p对小鼠骨实质来源间充质干细胞(MSC)成脂分化的影响。方法①取1周龄C57BL/6J小鼠胫骨和股骨分离培养MSC。体外培养扩增至P3代,吉姆萨染色,倒置显微镜镜下观察其形态;用流式细胞术检测其细胞表型;经成脂和成骨诱导液分别诱导分化7和14 d,分别用油红O染色和碱性磷酸酶染色检测其体外成脂和成骨分化能力,并用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测其成脂分化关键转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)以及成骨标志性蛋白骨钙素(OCN)和成骨分化关键转录因子Runx相关转录因子2(Runx2)mRNA表达。②合成与MSC成脂分化相关的微RNA(miRNA)即miR-25-3p模拟物,将miR-25-3p模拟物及其对照miRNA分别瞬时转染P3代MSC,用荧光显微镜观察转染细胞Cy3红色荧光强度鉴定细胞转染效率,RT-qPCR检测转染细胞miR-25-3p表达水平。③将未转染、转染对照miRNA和转染miR-25-3p模拟物的P3代MSC成脂诱导分化7 d,用油红O染色检测细胞脂滴形成数目,RT-qPCR检测其成脂分化关键转录因子CEBPα和PPARγmRNA表达水平。结果①倒置显微镜镜下观察发现,分离培养的骨实质来源P3代MSC呈贴壁式螺旋状生长。流式细胞术分析结果显示,P3代MSC高表达CD29,CD90,CD44和Sca-1,低表达或不表达MHC-Ⅱ,CD34,CD45和CD11b。油红O染色和碱性磷酸酶染色结果表明,成脂诱导分化7 d或成骨诱导分化14 d,P3代MSC形成大量脂滴且碱性磷酸酶活性增强,表明P3代MSC体外具有成脂和成骨分化能力;RT-qPCR检测结果表明,与自分化对照组相比,成脂诱导后MSC CEBPα和PPARγmRNA表达水平显著升高(P<0.01),成骨诱导后MSC OCN和Runx2 mRNA表达水平亦显著升高(P<0.01)。②荧光显微镜观察结果表明,Cy3荧光标记对照miRNA和miR-25-3p模拟物转染的MSC均可见大量红色荧光;RT-qPCR检测结果表明,与转染对照miRNA的MSC相比,转染miR-25-3p模拟物的MSC内源miR-25-3p表达水平显著升高(P<0.01)。③油红O染色结果表明,未转染、转染对照miRNA和转染miR-25-3p模拟物的MSC自分化组只有极少量脂滴,成脂诱导后3组与各自自分化组比较脂滴生成均明显增多(P<0.01),但转染miR-25-3p模拟物诱导组与转染对照miRNA诱导组相比脂滴数量明显减少(P<0.01)。RT-qPCR检测结果表明,未转染、转染对照miRNA和转染miR-25-3p模拟物的MSC自分化组均存在少量CEBPα和PPARγmRNA表达,成脂诱导后3组与各自自分化组比较CEBPα和PPARγmRNA表达水平均升高(P<0.01),但转染miR-25-3p模拟物诱导组与转染对照miRNA诱导组相比CEBPα和PPARγmRNA表达水平明显降低(P<0.01)。结论高表达miR-25-3p可抑制小鼠骨实质MSC的成脂分化。

幼龄1型糖尿病模型小鼠脂肪来源干细胞的鉴定及其成脂分化能力

目的比较幼龄1型糖尿病(T1DM)模型小鼠和幼龄正常小鼠脂肪来源干细胞(ADSC)的成脂分化能力,为阐明T1DM发病机制提供理论基础和实验依据。方法3周龄C57BL/6J小鼠,连续5 d ip给予小剂量(50 mg·kg^(-1))链脲佐菌素(STZ)制备幼龄T1DM小鼠模型;正常对照组ip给予等体积柠檬酸缓冲液;7 d后连续3 d小鼠尾静脉采血检测空腹血糖水平,空腹血糖均值≥16.7 mmol·L^(-1)认为幼龄小鼠T1DM建模成功。建模成功14 d后,取皮下脂肪和性腺周围脂肪组织,用组织酶消化法培养小鼠ADSC,倒置显微镜下观察细胞形态;用流式细胞术检测细胞表面标志物Sca-1、CD29、CD90、CD31、CD34、CD45、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ和CD11b。选取第3代(P3代)ADSC进行成骨和成脂诱导分化,分别用油红O染色和碱性磷酸酶染色检测细胞的成骨和成脂诱导分化能力,实时荧光定量PCR检测ADSC成骨关键转录因子骨钙素(Ost)和Runt相关转录因子2(Runx2)及成脂关键转录因子CCAAT增强子结合蛋白α(CEBPα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)mRNA表达。结果成功建立幼龄T1DM小鼠模型,并从T1DM模型小鼠脂肪组织分离获得ADSC,细胞形态呈成纤维样、贴壁生长,高表达CD29,CD90和Sca-1,低表达CD45,CD34,MHCⅡ,CD11b和CD31。幼龄T1DM模型小鼠P3代ADSC成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色阳性,Ost和Runx2 mRNA表达显著增高(P<0.01);成脂诱导分化后,油红O染色可见ADSC脂滴明显增多(P<0.01),PPARγ和CEBPαmRNA表达显著增高(P<0.01)。与正常对照组相比,幼龄T1DM模型小鼠ADSC脂滴数增多(P<0.01)且增大,PPARγ和CEBPαmRNA表达亦显著增高(P<0.01)。结论幼龄T1DM模型小鼠ADSC体外成脂分化能力增强。

鸟苷酸结合蛋白2对人脐带来源间充质干细胞成骨分化的调控作用

目的探讨鸟苷酸结合蛋白2(guanylate binding protein 2,GBP2)对人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell,hUC-MSC)成骨分化的调控作用。方法培养hUC-MSC,采用吉姆萨染色、流式细胞术及体外诱导分化等方法对hUC-MSC生物学特性进行鉴定;构建过表达GBP2的慢病毒载体,转染hUCMSC,荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率,实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,q-PCR)法检测转染后hUC-MSC中GBP2的表达,获得稳定过表达GBP2的hUC-MSC(GBP2^(high)hUC-MSC);采用流式细胞术和体外诱导分化试验检测GBP2^(high)hUC-MSC的生物学特性,油红O染色评价体外成脂分化能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色评估成骨分化能力,q-PCR法检测成脂和成骨分化相关转录因子的表达。结果培养的hUCMSC的细胞形态、细胞表型和诱导分化均符合MSC国际金标准。经GBP2慢病毒载体转染的hUC-MSC中GBP2的表达显著增加,获得稳定过表达GBP2的hUC-MSC(GBP2^(high)hUC-MSC)。GBP2^(high)hUC-MSC的细胞形态和细胞表型以及体外成脂分化能力均未发生变化,但成骨分化能力发生改变,GBP2^(high)hUC-MSC组ALP染色明显高于hUC-MSC组,成骨分化关键转录因子OPN和ALP的表达也显著高于hUC-MSC组(P均<0.05)。结论GBP2可促进hUCMSC的成骨分化,并上调成骨标志基因OPN和ALP的表达。

POSTN基因调控人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨骨膜蛋白调控人脐带来源间充质干细胞(hUC-MSC)向成骨细胞分化的作用。方法 培养并鉴定hUC-MSC,利用慢病毒载体构建稳定敲低POSTN基因的hUC-MSC(sh-POSTN-MSC)和对照组hUC-MSC(sh-NC-MSC),流式细胞术检测细胞表面标志物,油红O和碱性磷酸酶(ALP)染色比较两组细胞体外成脂和成骨诱导分化能力,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测成脂分化关键转录因子和成骨分化标志物表达的差异。结果 培养的sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC表面标志物均为CD73^(+)/CD90^(+)/CD105^(+)/CD14^(-)/CD34^(-)/CD45^(-),POSTN基因敲低后不影响hUC-MSC表面标志物的表达。成脂诱导后,sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC经染色均观察到红色脂滴出现。qRT-PCR结果显示,与自分化组相比,诱导组的脂肪酶(ADI)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达均明显增加(P<0.001)。成骨细胞诱导后,sh-NC-MSC和sh-POSTN-MSC经染色均观察到胞内ALP活性;qRT-PCR结果显示,二者诱导组成骨细胞标志物骨桥蛋白(OPN)表达均显著增加(P<0.001,P<0.01),提示sh-NC-MSC和sh-POSTNMSC具有成脂、成骨分化能力;同时,与sh-NC-MSC成骨诱导组相比,sh-POSTN-MSC成骨诱导组的胞内ALP活性明显降低,OPN和ALP的mRNA相对表达均显著降低(P<0.001)。结论 敲低POSTN基因的hUC-MSC成骨诱导分化能力降低,POSTN参与调控hUC-MSC的体外成骨分化作用。