环状RNA与心血管疾病关系的研究进展

环状RNA(circRNAs)是一类新型的非编码RNA,由前体RNA反向地首尾剪接形成。circRANs大量存在于真核生物细胞质中,且具有组织特异性和发育阶段特异性表达的特征。研究发现,circRNAs与心血管疾病的病理生理机制密切相关,在心力衰竭、心肌梗死、心肌病、高血压、动脉粥样硬化及心脏衰老等心血管疾病的发生发展中起重要作用。

外泌体microRNAs作为心血管疾病生物标志物的研究进展

心血管疾病诊断的生物标志物主要是对已知心肌蛋白的靶向分析和对心血管疾病的诊断变得越来越重要。肌酸激酶同工酶、肌红蛋白及肌钙蛋白等生物标志物目前已被广泛应用于临床,且肌钙蛋白被认为是急性心肌梗死诊断的金标准,但对其他心血管疾病的诊断缺乏特异性。外泌体的成分和生物学内容物对细胞激活和损伤具有特异性.

Mettl3通过PI3K/AKT信号通路调控Ang Ⅱ诱导肾脏纤维化的机制研究

目的:探讨甲基转移酶3(Mettl3)在血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导周细胞向肌成纤维细胞转分化及肾脏纤维化过程中的作用及相关机制。方法:使用C57BL/6J小鼠,(1)细胞实验中,采用磁珠分选法培养纯化小鼠肾脏周细胞,并予以1×10 6 mmol/L的Ang Ⅱ诱导周细胞-肌成纤维细胞转分化,为Ang Ⅱ组;正常培养的周细胞为对照组。采用免疫荧光染色、蛋白质印迹(Western blot)及实时反转录PCR(RT-qPCR)检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以验证转分化成功。采用斑点印迹、RT-qPCR、Western blot检测N6-甲基腺苷(m6A)修饰水平及相关酶[Mettl3、Mettl14、Wilms肿瘤蛋白1相关蛋白(WTAP)、肥胖相关蛋白(FTO)、ALKB同源蛋白5(ALKBH5)、YTH结构域家族蛋白(YTHDF)1、YTHDF2、YTHDC1、YTHDC2、YTHDC3]的表达水平。采用慢病毒转染Mettl3 shRNA的方法抑制细胞中的Mettl3表达,为sh-Mettl3组、Ang Ⅱ+sh-Mettl3组;以转染慢病毒空载体作为阴性对照,为Ang Ⅱ+sh-NC组,观察Ang Ⅱ对周细胞转分化的影响,并检测下游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路蛋白的表达,包括PI3K、AKT(丝氨酸磷酸化位点473)[p-AKT(S473)]、AKT(苏氨酸磷酸化位点308)[p-AKT(T308)]等。加入放线菌素D与各组周细胞共培养以抑制PI3K基因的转录,通过检测不同共培养时间残余PI3K mRNA表达量以计算PI3K mRNA半衰期。在Ang Ⅱ+sh-Mettl3组周细胞中加入AKT激动剂SC79,观察是否可逆转Mettl3抑制对Ang Ⅱ诱导周细胞-肌成纤维细胞转分化的作用。(2)动物实验中,分为假手术组(仅给予0.9%无菌生理盐水)、Ang Ⅱ组(泵入Ang Ⅱ溶液)、sh-Mettl3组(注射Mettl3 shRNA慢病毒溶液)、Ang Ⅱ+sh-Mettl3组(泵入Ang Ⅱ溶液+注射Mettl3 shRNA慢病毒溶液)、Ang Ⅱ+sh-Mettl3+SC79组(Ang Ⅱ+sh-Mettl3组处理基础上注射SC79),每组6只。手术前后采用尾夹法测定血压,术后4周测定血清肌酐、尿素含量及尿液白蛋白含量。28 d后取肾脏组织,采用苏木精-伊红(HE)及Masson三色法对组织切片进行染色,检测肾脏纤维化程度。 结果:(1)磁珠分选法可获得原代肾脏周细胞,以1×10 6 mmol/L的Ang Ⅱ处理周细胞48 h可成功诱导其向肌成纤维细胞转分化。斑点印迹结果显示,Ang Ⅱ组总RNA的m6A修饰水平高于对照组( P<0.05),RT-qPCR及Western blot结果显示,与对照组相比,Ang Ⅱ组中Mettl3 mRNA及蛋白表达水平上调( P均<0.05)。Ang Ⅱ+sh-Mettl3组细胞中的Mettl3蛋白表达水平低于Ang Ⅱ组,α-SMA、波形蛋白、肌间线蛋白、成纤维细胞激活蛋白a(FAPa)以及Ⅰ型胶原蛋白的表达水平亦低于Ang Ⅱ组( P均<0.05)。与对照组相比,Ang Ⅱ组的PI3K mRNA表达水平上调,且p-AKT(S473)和p-AKT(T308)蛋白高表达;Ang Ⅱ+sh-Mettl3组的PI3K mRNA表达水平低于Ang Ⅱ组,p-AKT(S473)和p-AKT(T308)蛋白表达下调( P均<0.05)。Ang Ⅱ+sh-Mettl3组的半衰期短于Ang Ⅱ+sh-NC组(2.34 h比3.42 h)。而Mettl3抑制对Ang Ⅱ诱导周细胞-肌成纤维细胞转分化的改善作用可被SC79逆转。(2)动物实验结果显示,与假手术组比较,Ang Ⅱ组小鼠的血压更高,血清肌酐、尿素及24 h尿蛋白测量值更高,纤维化面积更大( P均<0.05);而Ang Ⅱ+sh-Mettle3组的纤维化面积小于Ang Ⅱ组( P<0.05),但在加入SC79后肾脏纤维化又加重。 结论:Mettl3介导的RNA m6A表观遗传调控参与Ang Ⅱ诱导的肾脏周细胞-肌成纤维细胞转分化及肾脏纤维化,Mettl3可能通过影响PI3K的稳定性,进而影响PI3K/AKT信号通路发挥调控作用。

Mst-1调控缺氧复氧诱导的小鼠心肌细胞自噬及凋亡的机制

目的探索小鼠心肌细胞中哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,Mst-1)调控缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,HR)诱导的心肌细胞自噬及凋亡机制。方法采用酶消化法结合差速贴壁的方法培养小鼠乳鼠心肌细胞,通过缺氧24 h复氧6 h的方法建立HR模型。实验分组:对照组:正常培养的心肌细胞;Mst-1空病毒组:用重组慢病毒空载体转染心肌细胞48 h;Mst-1敲低组:用携带Mst-1小干扰RNA(siRNA)的重组慢病毒转染心肌细胞48 h;Mst-1过表达组:用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞48 h;HR组:建立心肌细胞HR模型;Mst-1敲低+HR组:用携带Mst-1 siRNA的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型;Mst-1过表达+HR组:用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型。采用实时荧光定量RCR(qPCR)以及Western blot检测细胞中Mst-1 mRNA及蛋白相对表达量,免疫荧光染色检测心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT),及细胞自噬体与自噬溶酶体变化,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡水平,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ,P62及凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶剪切体(cleaved-caspase)9、半胱氨酸天冬氨酸酶前体(pro-caspase)9、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3,以及髓细胞白血病1基因(MCL-1)的表达情况达。予以MCL-1抑制剂A1210477做回复实验,验证Mst-1通过调控MCL-1参与心肌细胞凋亡及自噬。结果免疫荧光检测发现培养细胞表达心肌细胞特异性标志物cTnT;HR情况下心肌细胞中Mst-1表达增加,慢病毒转染可有效抑制或过表达细胞中Mst-1。HR组与Mst-1过表达+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量低于对照组,而Mst-1敲低+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量高于HR组(P均<0.05)。TUNEL结果显示,HR组及Mst-1过表达+HR组中TUNEL阳性细胞比例高于对照组,而Mst-1敲低组+HR组中TUNEL阳性细胞比例低于HR组(P均<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,HR组及Mst-1过表达+HR组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值较低,P62与cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较高(P均<0.05);与HR组比较,Mst-1敲低+HR组中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值较高,P62与cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较低(P均<0.05)。HR与Mst-1过表达+HR组心肌细胞中磷酸化(P)MCL-1蛋白表达水平低于对照组,Mst-1敲低+HR组的P-MCL-1蛋白表达水平高于HR组(P均<0.05)。回复实验显示抑制细胞中MCL-1可阻断Mst-1 siRNA对细胞自噬及凋亡的调节作用。结论抑制心肌细胞中Mst-1的表达,可促进HR诱导的心肌细胞自噬,改善心肌细胞凋亡,该作用可能与其调控MCL-1表达相关。