白藜芦醇抑制HCT116结肠癌细胞增殖与Wnt/β-catenin的关系研究

目的研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及可能的分子机制。方法采用结晶紫染色和Western blot分析Res对HCT116细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞术和Western blot分析Res对HCT116细胞凋亡的促进作用;利用TCF4/LEF萤光素酶报告质粒检测Res对Wnt/β-catenin信号转导的影响。采用Western blot和PCR分析Res对HCT116细胞内β-catenin表达水平的影响。结果与对照组相比,Res能抑制HCT116细胞增殖,下调PCNA蛋白水平;流式细胞术和Western blot检测结果均显示,Res能明显促进HCT116细胞凋亡;报告质粒分析结果显示,Res呈浓度依赖性降低TCF4/LEF报告质粒萤光素酶活性(Res为20μmol·L-1时,P<0.05;Res为40或80μmol·L-1时,P<0.01);Western blot和PCR分析结果显示,Res不仅明显降低HCT116细胞中β-catenin的蛋白水平,同时也下调β-catenin mRNA的表达水平。结论Res能抑制HCT116细胞增殖并促进凋亡,其机制可能至少与Res下调β-catenin mRNA表达,抑制Wnt/β-catenin信号转导有关。

胰岛素样生长因子结合蛋白5与汉防己甲素抑制人结肠癌细胞增殖的关系研究

目的研究汉防己甲素(tetrandrine,Tet)抑制结肠癌细胞增殖作用及其可能的分子机制。方法采用结晶紫染色和流式细胞术检测不同浓度Tet对结肠癌Lo Vo细胞增殖的抑制作用。采用流式细胞术分析Tet对Lo Vo细胞凋亡的促进作用。利用Western blot检测Tet对IGFBP-5的表达影响。采用荧光素酶报告质粒,IGFBP5以及IGFBP5 siRNA的重组腺病毒,研究Tet抑制结肠癌细胞增殖的分子机制。结果Tet能明显抑制Lo Vo细胞增殖,并能诱导G1期阻滞,同时促进Lo Vo细胞凋亡。Tet呈浓度依赖性降低Lo Vo细胞中IGFBP5的表达水平。与对照组相比,Tet明显抑制TOPluc报告质粒的转录活性,外源性过表达IGFBP5能部分逆转这种抑制作用;Tet明显下调Lo Vo细胞中c-Myc表达水平,外源性过表达IGFBP5能部分逆转,但沉默IGFBP5表达不能逆转Tet对c-Myc表达水平的抑制作用。结论 Tet能抑制结肠癌细胞Lo Vo的增殖,并诱导凋亡,这种作用可能与Tet通过下调IGFBP5表达进而抑制Wnt/β-catenin信号有关。

环氧酶-2在骨形态蛋白9诱导间充质干细胞骨向分化中的作用研究

目的研究环氧酶-2(COX-2)在骨形态蛋白9(BMP9)诱导间充质干细胞(MSCs)成骨分化过程中的作用,以及COX-2影响BMP9功能的可能机制。方法采用定量PCR、蛋白印迹和免疫细胞化学染色分析BMP9对COX-2表达的影响。采用化学发光法检测碱性磷酸酶(ALP)的活性,用RT-PCR法检测Smad6、Smad7 mRNA表达水平,用蛋白印迹检测Runx2、Dlx-5、Smad1/5/8及磷酸化Smad1/5/8蛋白水平。通过体内异位成骨实验检测COX-2对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。利用萤光素酶报告质粒检测BMPs/Smads信号活化程度。结果 BMP9明显诱导COX-2表达,抑制COX-2酶活性或沉默COX-2均抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞ALP活性增加。沉默COX-2明显抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞表达Runx2和Dlx-5,以及BMP9诱导的C3H10T1/2细胞异位成骨。沉默COX-2抑制BMPR-Smad报告质粒萤光素酶活性,降低Smad1/5/8的磷酸化水平,以及抑制Smad6和Smad7的mRNA表达。结论 COX-2对BMP9诱导MSCs成骨分化具有重要调节作用,其机制可能与COX-2调节BMPs/Smads信号转导有关。

PI3K/Akt信号与吴茱萸碱抑制人结肠癌细胞增殖的关系研究

目的研究吴茱萸碱(Evodiamine,Evo)对结肠癌Lo Vo细胞增殖的抑制作用及可能的分子机制。方法采用结晶紫染色分析Evo(0、0.5、1、2、4μmol/L)对Lo Vo细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞术分析Evo(0、0.5、1、2μmol/L)对Lo Vo细胞凋亡的促进作用;Western blot法分析Evo(0、0.5、1μmol/L)对Lo Vo细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及Caspase-3蛋白表达水平的影响;利用缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1-alpha,HIF-1α)荧光素酶报告质粒检测Evo(0、0.5、1、2μmol/L)对HIF-1α转录活性的影响。采用Western blot法分析Evo(0、0.5、1、2μmol/L)对Lo Vo细胞中HIF-1α、Akt1/2和磷酸化Akt1/2蛋白水平的影响。结果与对照组相比,Evo明显抑制Lo Vo细胞增殖,下调PCNA蛋白水平,促进Lo Vo细胞凋亡;报告质粒统计结果显示,Evo呈浓度依赖性降低HIF-1α荧光素酶报告质粒活性(Evo为0.5μmol/L时,P<0.05;Evo为1μmol/L或2μmol/L时,P<0.01);Western blot检测结果显示,Evo能够明显降低HIF-1α蛋白水平,下调Akt1/2磷酸化水平。结论 Evo能够抑制Lo Vo细胞增殖并促进凋亡,其机制可能与Evo下调HIF-1α蛋白表达,抑制PI3K/Akt信号转导相关。

白藜芦醇抑制人结肠癌细胞增殖及其与PTEN的关系研究

目的研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对人结肠癌细胞增殖的抑制作用及可能的机制。方法采用结晶紫染色、流式细胞术和Western blot分析Res对HCT116细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞术和免疫荧光分析Res对HCT116细胞凋亡的促进作用;采用Western blot和PCR分析Res对HCT116细胞内Akt1/2及PTEN表达水平的影响;通过重组腺病毒介导的PTEN过表达或沉黙表达,分析Res抑制HCT116细胞增殖及其与PTEN的关系。结果与对照组相比,Res处理组HCT116细胞增殖受到抑制(P<0.05,P<0.01),G1期细胞比例也随Res浓度增加而升高,同时PCNA蛋白表达水平下降;流式细胞术分析结果显示,Res能明显促进HCT116细胞凋亡;Western blot和PCR分析结果显示,Res对Akt1/2 mRNA表达无明显影响,但能降低Akt1/2的磷酸化水平,同时促进PTEN表达。外源性过表达PTEN能增强Res对HCT116细胞的增殖抑制作用(P<0.01),而沉黙PTEN表达能部分逆转Res对HCT116细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。结论 Res对HCT116细胞增殖具有抑制作用,并能促进其凋亡;Res的这种作用可能与其促进PTEN表达,抑制PI3K/Akt活化有关。

PTEN在骨形态发生蛋白9诱导小鼠胚胎成纤细胞骨向分化中的作用

目的研究PTEN对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化的影响,并分析PTEN调节BMP9功能的可能机制。方法采用定量PCR检测PTEN在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达,分析在MEFs中BMP9对PTEN表达的影响。采用组织化学染色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,PCR检测OPN和OCN的表达水平,茜素红染色检测钙盐沉积,分析PTEN对BMP9诱导MEFs成骨分化的影响;利用荧光素酶报告质粒和蛋白印迹等方法分析PTEN对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)/Smads信号转导的影响。结果 PTEN在几种常见MSCs中均有表达;BMP9在MEFs中明显抑制PTEN的表达。抑制PTEN能促进BMP9诱导MEFs的ALP活性增加,但过表达PTEN对BMP9诱导MEFs的ALP活性有明显抑制作用。抑制PTEN明显促进BMP9在MEFs细胞中诱导的OCN表达,并增强钙盐沉积。报告质粒分析结果显示,抑制PTEN能明显增强BMPR-Smad报告质粒的转录活性,并增加Smad1/5/8的磷酸化水平。结论下调PTEN表达可能是BMP9诱导MEFs成骨分化重要途径之一,其机制可能与促进BMPs/Smads信号转导有关。

辐照对重酒石酸间羟胺注射液含量的影响考察

目的:建立测定重酒石酸间羟胺注射液(MBI)含量的方法,并考察其辐照不同强度的γ射线后含量的变化。方法:采用高效液相色谱法测定含量,色谱柱为Diamonsil Technology C18,流动相为甲醇-0.03%庚烷磺酸钠溶液(pH3.0)(35∶65),流速为1.0mL·min-1,检测波长为272nm。将同一批MBI放置于60Co-γ射线放射源中,一次性辐照1、2、4、8、16、25kGy的强度后检测药物含量,并与辐照前比较。结果:重酒石酸间羟胺检测浓度线性范围为8～24μg·mL-(1r=0.99996);低、中、高浓度的平均回收率为99.87%、100.15%、99.92%;日间及日内RSD均小于2%。辐照前与辐照1、2、4、8、16、25kGy强度后的含量分别约为20.03、19.73、19.59、19.53、19.48、19.32、18.86μg·mL-(1辐照前后比较:P<0.01)。结论:所建立的方法可用于MBI的含量测定;辐照下MBI液具有不稳定性,随着辐照强度的增加其含量下降显著。