犬瘟热病毒H蛋白的原核表达及免疫原性的初步鉴定

本研究旨在对犬瘟热病毒(CDV)疫苗株H基因进行克隆及原核表达,并对产物的免疫原性做初步鉴定。根据犬瘟热病毒参考株Ondetstepoort的H基因序列,去除信号肽序列并选取其主要抗原表位设计引物,用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的片段;产物克隆至表达载体pET28b并转化宿主菌RosettaTM,优化诱导表达条件,纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE鉴定、Western blotting分析及间接酶联免疫吸附试验(ELISA);并将纯化的H蛋白免疫小鼠,进行中和试验检测抗体效价。结果显示,PCR扩增得到1113bp DNA片段;在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导条件下可获得较高水平的表达;经SDS-PAGE鉴定,表达的H蛋白分子质量为42.38ku,与预期值相符;Western blotting显示,在42.38ku出现特异性目的条带;ELISA结果显示,表达的H蛋白能被抗CDV抗体识别,但与正常血清未发生非特异性反应;中和试验结果表明,血清中和抗体效价约为2-3.3。结果提示,H蛋白获得了正确表达,对CDV抗血清具有特异反应性,可作为实时检测动物机体免疫状况检测的候选抗原,为进一步研制犬瘟热抗体检测ELISA试剂盒和新型疫苗奠定基础。

半套式RT-PCR检测动物狂犬病病毒的研究

基于我国流行的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)均属基因I型,本研究根据GenBank公布的31株RV N基因全序列,选取保守区域设计2对引物,建立了一种检测RV的半套式聚合酶链式反应(Semi-nested RT-PCR),并对引物的灵敏性、敏感性和特异性进行检测。将该方法检测的36份新鲜脑组织样品,与荧光抗体染色法(FAT)进行比较,并将PCR结果为阳性的新鲜样品室温下放置腐败后进行检测。结果显示,该方法灵敏度检测可达到0.01TCID50/mL。对检测呈阳性的病料进行序列分析,全部为狂犬病病毒;检测犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病病毒(CAV)、伪狂犬病病毒(PRV)等非狂犬病病毒,结果均为阴性,表明该引物特异性较高。该方法与FAT检测结果完全一致,并能从腐败样品中检出RV,更适用于腐败样品的检测,具有快速、准确的特点,可广泛应用于广大基层狂犬病的诊断及试验研究。

表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性的初步分析

拟构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)QS10株S1蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒,并在本动物上进行初步的免疫学试验。通过RT-PCR获得S1基因,插入腺病毒表达系统穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-S1,转染293AD细胞获得表达S1蛋白的重组腺病毒。PCR检测显示,S1基因已重组到腺病毒基因组;间接免疫荧光和Western blot检测证明该重组病毒在293AD细胞中真实表达了具有免疫反应性的IBV S1糖蛋白。重组病毒培养滴度可达到107 TCID50.mL-1。免疫接种SPF鸡后,通过ELISA检测,免疫鸡产生了针对IBV的特异性抗体。作者成功构建了表达IBV S1蛋白的重组腺病毒,该重组病毒可在SPF鸡体内诱导产生IBV特异性抗体。

狂犬病病毒糖蛋白在毕赤酵母GS115中的表达及产物特性研究

本试验旨在利用毕赤酵母系统表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(GP)基因,并对重组蛋白进行反应原性研究。构建重组表达质粒pPiczαA-G,线性化后电转入酵母GS115中,经平板初筛及PCR鉴定正确后命名为pPiczαA-G-GS115。重组菌经1.0%甲醇诱导表达,对目的蛋白进行双抗体夹心ELISA检测、SDS-PAGE电泳、Western blot分析。结果表明,ELISA检测诱导72 h重组蛋白表达量最高;SDS-PAGE分析显示目的蛋白相对分子量约为65 kD,与理论值相符。Western blot结果表明,重组蛋白可与RV阳性血清发生特异性反应。本试验为进一步研制狂犬病病毒ELISA抗体诊断试剂盒奠定基础。

水貂养殖场之生物安全防护措施

水貂是一种珍贵的毛皮兽动物，水貂皮坚韧轻薄，美观保暖，可制作高档裘皮服装及袭皮制品，价值不菲。在国际市场上，貂皮销路稳定，需求量逐年上升，因此集约化、规模化养貂场大量兴起，随之而来的环境微生物生态平衡受到破坏，导致流行疫病的种类日趋增多，给水貂养殖户造成了巨大的经济损失。而建立水貂场的生物安全体系，就是为了通过采取适宜安全的防范措施，消除外界致病因素，减少疫病发生，保障养貂业的健康发展。

犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒的构建及免疫效果评估

研究选取犬瘟热病毒H蛋白基因为目的基因,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶切、连接等方法构建出重组人5型腺病毒穿梭质粒和骨架质粒,两者共转染293AD细胞并包装出重组腺病毒。通过电镜负染、酶切鉴定、Western blot及一步生长曲线测定等方法进行病毒的生物学特性鉴定,证明犬瘟热病毒H蛋白基因重组腺病毒构建正确。犬分别肌肉接种CDV疫苗毒和重组腺病毒,并检测免疫后第14,28,42,56,70,84d时犬血清中抗CDV中和抗体的变化情况。结果显示,犬免疫重组腺病毒后体内产生的抗CDV平均中和抗体水平高于对照组,滴度最高达2-8。研究表明,正确构建的重组腺病毒具有良好的免疫原性,诱导产生的抗犬瘟热病毒中和抗体达到犬最低免疫保护水平,为进一步研发犬瘟热病毒活载体疫苗提供理论依据。

基因1型狂犬病病毒核酸巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

针对我国狂犬病临床诊断的现实需求,本研究根据狂犬病病毒基因组核苷酸保守序列,设计巢式引物,对引物工作浓度和退火温度进行了优化,并对RT-PCR敏感性、特异性和重复性进行了检验。结果显示,巢式RT-PCR方法最低能够检测0.01MILD50/30μL的脑组织病毒量,对阳性样品和非狂犬病感染样品的3次重复检测结果均与狂犬病诊断OIE推荐方法(荧光抗体染色法)的确定结果完全一致;在针对203份临床样品的检测中,FAT疑似样品通过MIT和巢式RT-PCR进一步确诊,巢式RT-PCR显示出较高的敏感性和特异性。以上表明,本研究建立的狂犬病病毒核酸巢式RT-PCR方法高度敏感和特异,可以用于FAT和MIT疑似样品的辅助检测,为试剂盒的研发与应用奠定基础。

我国蝙蝠狂犬病病毒IRKV-THChina12株适应细胞培养后的分子生物学特性

通过对IRKV-THChina12适应细胞培养前后全基因组序列分析比对及与对不同种属狂犬病病毒氨基酸的比对,鉴定我国狂犬病病毒IRKV-THChina12株适应细胞培养后的分子生物学特性。结果显示,适应细胞培养后共发生11个核苷酸突变点和5个氨基酸突变点,其中1个氨基酸变异发生在P蛋白相互作用的LC8区域,2个氨基酸突变发生在M蛋白编码区,1个氨基酸突变发生在G(333位精氨酸未改变)蛋白编码区,L蛋白仅有1个氨基酸突变。结果表明,可能多个结构蛋白同时决定了病毒在Vero细胞的适应性,明确了本细胞适应毒株的分子生物学特性,为在细胞水平开展相关科学研究奠定了基础。