大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的过表达

目的构建携带大鼠瘦素(leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。方法提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用Spe I和EcoR V双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。结果测序证实瘦素基因与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5×1012vg/mL纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA-Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP感染鼠神经元细胞5d后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。结论成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。

miR-21在鼻咽癌中的表达及对鼻咽癌细胞株增殖及凋亡的影响

目的研究miR-21在鼻咽癌组织及细胞中的表达,并分析miR-21反义核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用荧光定量RT-PCR方法检测miR-21在鼻咽癌组织及细胞株中的表达;利用脂质体Lipofectamine TM2000将miR-21 ASO瞬时转染至鼻咽癌细胞,通过荧光定量RT-PCR检测miR-21的沉默效果。利用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)、平板克隆形成实验检测miR-21对细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-21对细胞周期的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡-Annexin V-FITC/PI双染色法检测miR-21对鼻咽癌细胞凋亡的影响;蛋白质印迹法(Western blot)检测caspase-3蛋白的表达;caspase-3活性检测试剂盒检测沉默miR-21后caspase-3的活性变化。结果 miR-21在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞中显著高表达;MTT法分析显示,细胞接种96 h后,5-8F/miR-21 ASO组的生长速度较对照组显著下降(P<0.05),细胞克隆形成率较对照组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);细胞周期结果表明沉默miR-21表达的细胞增殖受抑,主要通过诱导G0/G1期阻滞,减少S期细胞的比例;流式细胞仪检测结果显示转染miR-21 ASO组较对照组细胞凋亡率明显增加,并且caspase-3的活性明显增强。结论 miR-21在鼻咽癌组织及细胞中表达上调,靶向miR-21可有效抑制鼻咽癌细胞增殖、促进细胞凋亡。miR-21的表达可能影响鼻咽癌细胞的生长。

ACE2在鼻咽癌中的表达及对鼻咽癌细胞增殖的影响

目的:探讨血管紧张素转化酶2(ACE2)在鼻咽癌中的表达并观察ACE2激动剂二乙酰胺三氮脒(DIZE)对鼻咽癌细胞增殖的影响,以及对ACE2、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素(1-7)[Ang(1-7)]和表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响。方法:采用免疫组织化学(IHC)En Vision法检测ACE2在66例鼻咽癌、175例鼻咽黏膜慢性炎组织中的表达,以及EGFR在88例鼻咽癌组织中的表达;采用荧光定量RT-PCR法检测ACE2在鼻咽癌细胞中的表达;处理鼻咽癌细胞,采用MTT及平板克隆形成实验检测其对鼻咽癌细胞生长的影响,检测DIZE对ACE2、AngⅡ、Ang(1-7)和EGFR表达的影响。结果:在66例鼻咽癌标本中,均未观察到ACE2的表达,而在黏膜慢性炎标本中,ACE2表达的阳性率为69.7%;鼻咽癌细胞中ACE2的表达显著降低,且与细胞的分化相关;在鼻咽癌组织中EGFR高表达,阳性率为97.7%;DIZE作用于鼻咽癌细胞后,ACE2及Ang-(1-7)的表达升高,AngⅡ与EGFR的表达降低,并且可抑制鼻咽癌细胞的生长及克隆形成。结论:ACE2在鼻咽癌组织与细胞中低表达,ACE2激动剂DIZE可提高ACE2的水平,并且可抑制鼻咽癌细胞增殖。

沉默变异性浆细胞瘤异位1抑制鼻咽癌细胞增殖作用的机制研究

目的探讨变异性浆细胞瘤异位1(plasmacyto-mavarianttranslocation1,PVT1)抑制鼻咽癌细胞增殖的分子机制。方法构建特异性的shRNA PVT1慢病毒载体,包装慢病毒(LV/shRNA PVT1)并转导鼻咽癌C666-1细胞,检测Smad4的表达;LV/shRNA PVT1转导C666-1细胞24 h后转染Smad4 siRNA,通过细胞计数、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及流式细胞术分析沉默Smad4对LV/shRNA PVT1介导的鼻咽癌细胞生长及细胞周期的影响,并检测细胞周期相关调控因子的表达。结果下调PVT1后鼻咽癌细胞中Smad4的表达升高,而用siRNA沉默Smad4表达后,结果显示,抑制Smad4表达可阻断LV/shRNA PVT1介导的细胞生长抑制效应,同时细胞周期结果显示,与对照组相比,shRNA PVT1/Smad4 siRNA组细胞G1期比例降低,S期和G2期比例升高,并且CDK4、CDK6及c-myc的mRNA水平升高。结论下调PVT1可抑制鼻咽癌细胞增殖,并升高Smad4的表达,沉默Smad4可阻断shRNA PVT1对鼻咽癌细胞增殖的抑制效应;提示Smad4可能是PVT1作用的一个下游靶基因,下调PVT1可能通过Smad4抑制鼻咽癌细胞增殖。

关于乡镇综合行政执法改革的实践与思考

乡镇为经济社会发展提供了大部分的人力和物力资源,是县域经济高质量发展的主要组成部分,是社会发展的重要基础。乡镇政府作为直面群众,直接提供服务、受理诉求的治理一线,治理能力高低直接影响人民群众的幸福感、获得感。

基于JAK2/STAT3通路探讨藏红花素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响

目的基于Janus激酶2/信号转导与转录激活子3(JAK2/STAT3)通路探讨藏红花素对大鼠局灶性脑缺血再灌注(FCIR)损伤的影响。方法96只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、藏红花素(20 mg/kg)组、藏红花素(20 mg/kg)+香豆霉素(JAK2激活剂,0.1 mg/kg)组,每组24只;采用线栓法复制FCIR大鼠模型。造模前7 d开始,各组分别1次/d腹腔注射(ip)给药,假手术组和模型组ip给予生理盐水。再灌注24 h后,通过Longa评分考察大鼠神经功能缺损状况,TTC染色法计算脑梗死率,HE染色、TUNEL染色法观察皮质神经元病理学改变和凋亡状况,ELISA法检测脑组织TNF-α、IL-1β水平,Western blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Caspase-3、Cleved Caspase-3、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果与模型组相比,藏红花素组大鼠Longa评分和脑梗死率降低(P<0.05);皮质神经元排列紊乱、数量减少、空泡变性、胞浆固缩深染、核膜边界不清、炎细胞浸润等病变明显改善,凋亡指数降低(P<0.05);TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05),pJAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Cleved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2表达比值和HMGB1表达量降低(P<0.05)。香豆霉素明显逆转藏红花素对FCIR大鼠上述各指标的调控作用(P<0.05)。结论藏红花素可抑制FCIR大鼠炎症反应和皮质神经元凋亡,对大鼠FCIR损伤起到保护作用,其机制可能与抑制JAK2/STAT3通路活化有关。

浅谈FLAC3D在边坡动力稳定性中的应用

随着电子计算机的应用越来越广泛,数值分析方法在岩土工程、工程地质领域也获得了飞速发展,为研究岩土工程和工程地质问题提供了强有力的手段。借助FLAC3D软件,结合某边坡工程,模拟并分析在地震作用下边坡的稳定性。

土壤铅污染的微生物修复研究进展

通过介绍土壤环境中铅的形态、铅污染的来源及其对生物的危害,阐述了土壤重金属铅污染的微生物修复机理:土壤中的铅可以通过微生物的生物吸附、转化等作用降低土壤中有效铅的含量,从而降低其对植物的毒性,达到修复土壤铅污染的目的。叙述了微生物修复土壤的弊端、植物-微生物联合修复及生物工程改良菌的应用等,并对土壤铅污染微生物修复的发展趋势进行了展望。

人血管紧张素Ⅱ2型受体AT2R重组细胞系的构建与鉴定

目的:构建人血管紧张素Ⅱ2型受体(hAT2R)过表达稳定细胞系,探讨AT2R激动剂Compound 21等对前列腺癌细胞的作用及机制.方法:构建含hAT2R基因的慢病毒表达载体pLV-CMV-hAT2R-IRES-eGFP并包装成慢病毒.将重组慢病毒载体pLV-CMV-IRES-eGFP-hAT2R感染前列腺癌细胞,并利用流式细胞术筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot方法检测重组细胞系中hAT2R表达水平,使用AT2R激动剂CGP42112检测受体功能.结果:重组慢病毒载体感染PC-3、DU145前列腺癌细胞24 h后均能观察到eGFP表达,用流式细胞术分别筛选出单克隆细胞株,RT-PCR及Western blot检测结果显示目的基因hAT2R在两株重组细胞系中表达显著升高,CGP42112处理24 h后,重组细胞系细胞活力较正常PC-3、DU145细胞显著降低.结论:成功构建hAT2R过表达稳定细胞系.

地理自制教具对培养学生地理核心素养的意义

地理自制教具在教学活动中具有独特的生命力,在课堂上利用地理自制教具突破教学重点是培养学生地理学科核心素养的有效途径之一。地理教师通过指导学生制作地理教具,有助于培养学生的实践能力、空间想象能力、综合思维、人地观念,有助于发展学生的核心素养体系,提高学生的学业质量。

思维导图在高中地理课堂教学中的应用案例分析

思维导图是利用符号、颜色、图像等来激发大脑思维,表征人脑思维过程,整理思路的一种工具,可以形成可视化的知识图谱。在高中地理课堂教学中使用思维导图,可以引导学生逐步厘清知识脉络,构建起知识框架,培养发散思维能力。

体育教师的世界

毕首金是昆明市官渡区白汉场中心小学的体育教师1984年报考体院落榜后，毕首金考取了合同制教师资格当时，作为合同制教师的他，每月工资不足20元、但他一干就是12年，直到1996年才通过考试转为公办教师，到今年，毕老师教体育已满30年。

留守厂长的操守

19年前，武汉市江夏区第一服装厂倒闭了，职工作鸟兽散。本可以一心一意打理自己的小生意，但徐家尧毅然地站出来，当起一分钱工资也没有的留守厂长.

宫崎骏的终身成就

当地时间8月28日，奥斯卡主办方美国电影艺术与科学学院宣布新一届的奥斯卡终身成就奖得主是日本动画片导演宫崎骏和另外两名电影人.

高三女生的天地

8月26日上午，在成都双流中学的会议室，高三学生曾雪把33000元钱送到10名同学手中，每人3000元、4000元不等，用以资助他们上大学。

管教民警的仁心

十年前，叶剑雄转业到深圳市龙岗区看守所当了管教民警，接触的第一个重犯陈某表现异常：数日不发一言，拒绝与人交流。叶剑雄每天都去找陈某，给他讲军中趣闻．渐渐地，距离拉近了，陈某对警方态度也转变了．陈某在转至深圳市第二看守所前夕，找到叶剑雄，希望能与他保持书信联系.

杨红樱的儿童情结

在中国作家富豪榜上，杨红樱多年位居前十，并在2010年成为作家富豪榜“首富”。

新高考背景下地理职业生涯规划教育探究

新高考背景下，学生由被动的“考什么学什么”到主动的“选什么学什么”转变，专业选择和职业生涯规划教育越来越受到重视。本文就地理职业生涯规划的意义，以及通过开设专门地理职业生涯规划课程和学科渗透相结合的方式开展地理职业生涯规划教育进行探究。

初中地理教学中人地协调观的培养策略

人地协调观作为地理核心素养的重要内容，是地理教育的基本价值观念，在中学地理教育中占有举足轻重的地位。为此，从夯实地理核心知识、提升地理思维能力、鼓励地理实践操作和开展合作探究活动四方面，对初中地理教学中人地协调观的培养策略进行阐述。

创设真实性地理教学情境,促进学生深度学习

当前的课程改革要求以核心素养为出发点,重视学生能力的培养。而基于核心素养的学习必然是深度学习,创设真实性地理教学情境实施教学是实现学生深度学习的有效途径。文章从真实性地理教学情境和深度学习的内涵、真实性地理教学情境对学生深度学习的促进意义等角度进行具体阐述。