青花菜线粒体基因组组装与序列特征分析

为更好地从分子水平了解青花菜,对青花菜进行线粒体基因组组装,并对其序列特征进行分析。青花菜线粒体基因组大小为219964 bp,GC含量为45.25%。线粒体基因组注释到61个基因,包括33个编码蛋白基因,23个tRNA基因,3个rRNA基因和2个假基因。其中8个基因的核苷酸多样性较高;24个基因无核酸多样性。变异数量最多的基因是rrn26、rrn18和atp1,其变异数量分别为326、277和136。密码子偏好性分析结果显示RSCU值>1的密码子有29个,大多以A/U碱基结尾,表明其密码子更偏向于A/U结尾。基因组序列中共检测到345个重复序列,包括170个正向重复序列和175个回文重复序列。青花菜与花椰菜的线粒体基因组具有极好的共线性,且基因的位置基本一致。青花菜线粒体和叶绿体基因组中共检测到22条同源片段。同源片段总长度为13355 bp,平均607bp。

非生物胁迫下青花菜内参基因的筛选

【目的】检测非生物胁迫下常见内参基因的表达稳定性,筛选出青花菜的适宜内参基因。【方法】以青花菜高代自交系“KU19-3”为试验材料,利用已有的转录组数据和文献,筛选出31个候选内参基因,对其在不同非生物胁迫下(盐、干旱、渍水、弱光、高温和低温)的表达水平进行荧光定量PCR检测,采用geNorm、Normfinder和BestKeeper软件分析其表达稳定性,从而筛选出适宜的内参基因。【结果】31个候选内参基因的扩增特异性良好,且表达水平差异明显。其中BOL029171的Ct值最小,表达量最大;而BOL001470的Ct值最大,表达量最小。其他基因的Ct值介于20~40。3种软件综合分析结果表明:BOL034565和BOL008820在高温胁迫下最稳定,BOL043724和BOL005937在弱光胁迫下表达稳定性最好,BOL043724和BOL001470、BOL005937和BOL006136分别在低温和盐胁迫下表达最稳定,BOL024326和BOL025875、BOL008820和BOL001788分别在渍水和干旱胁迫处理下表达最稳定。综合上述得出BOL006136和BOL008820可作为非生物胁迫下青花菜的通用内参基因。【结论】本研究筛选出青花菜在非生物胁迫下通用内参基因是BOL006136和BOL008820,结果可为以后开展青花菜逆境胁迫下相关基因的表达特征研究和青花菜抗逆种质创建提供一定的科学基础。

青花菜BoWHY2基因克隆及其高温胁迫下的表达特征

【目的】分析青花菜BoWHY2基因的序列特征和分子进化概况,检测高温胁迫下的表达特征,为揭示青花菜BoWHY2基因高温胁迫下的应答机制提供依据。【方法】利用PCR技术克隆青花菜BoWHY2基因序列,并分析其序列特征、分子进化和高温胁迫下的表达特征。【结果】克隆获得青花菜BoWHY2基因,其CDS区域长度为723 bp,推导编码240个氨基酸。该蛋白分子量为26.2 kD,属于碱性蛋白,疏水性较好,理论等电点为9.48,其表面有1个中心空穴并形成带电的内腔。青花菜BoWHY2基因在高温胁迫下的相对表达量处理3 h时下降,处理12 h时升高。青花菜BoWHY2基因与甘蓝和油菜的进化关系较近。【结论】青花菜BoWHY2基因与甘蓝和油菜的进化关系较近,保守性较强;BoWHY2基因在高温胁迫下其表达量持续升高,对高温胁迫能够做出正向反应。

非生物胁迫下青花菜LncRNA内参基因的筛选

长链非编码RNA在植物抵御逆境胁迫中起着重要作用.适宜的内参基因是准确评价其表达水平的基础.本研究利用实时荧光定量PCR技术检测16个青花菜LncRNAs表达水平,并通过geNorm、Norm-Finder、BestKeerper软件进行表达稳定性分析.结果表明:青花菜的16个LncRNAs在不同逆境胁迫下表达稳定性存在差异.其中在弱光胁迫条件下,XLOC_000400表达最稳定;在低温胁迫条件下XLOC_030832基因稳定性最好;在干旱和渍水胁迫条件下最稳定表达的内参基因分别是XLOC_007087和XLOC_012179;高温和盐胁迫处理下最稳定表达的内参基因均为XLOC_007980.XLOC_010342和XLOC_007980在青花菜不同逆境胁迫下的表达稳定性较好.研究结果可为准确定量青花菜不同逆境胁迫下的LncRNAs提供合适的内参基因.

青花菜花蕾发育LncRNAs内参基因筛选

在分析青花菜花蕾发育过程长链非编码RNA(LncRNAs)的表达中,筛选稳定表达的内参基因至关重要。通过前期高通量测序筛选出16个候选内参基因,利用qRT-PCR技术检测其表达水平,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件对16个LncRNAs在青花菜花蕾不同部位和不同发育时期的表达稳定性进行分析。结果表明,在花蕾不同部位中,geNorm算法认为XLOC_000400、XLOC_008536、XLOC_034059为最适内参基因;NormFinder计算XLOC_021473、XLOC_000400、XLOC_034059为最佳内参基因;BestKeeper显示XLOC_025578表达最稳定。在花蕾不同发育时期中,geNorm算法认为XLOC_000108、XLOC_039609、XLOC_021473为最适内参基因;NormFinder计算XLOC_021473、XLOC_039609、XLOC_000108为最佳内参基因;BestKeeper显示XLOC_034059表达最稳定。综合评估后,在花蕾不同部位和不同发育时期中适宜的内参基因对分别为XLOC_000400/XLOC_008536和XLOC_039609/XLOC_021473。

青花菜E3泛素连接酶基因的克隆及表达分析

为探讨泛素蛋白酶体在高温胁迫下参与蛋白质降解途径相关的生理过程和功能,以青花菜‘KUQ19⁃27’为试验材料进行高温胁迫(38℃)处理,设计特异性引物从青花菜中克隆得到青花菜E3泛素连接酶基因并进行生物学信息分析,并运用实时荧光定量PCR技术分析其表达特征.结果显示:E3泛素连接酶基因的ORF长度为1332 bp,编码443个氨基酸,相对分子量为48.3 kD.亲疏水性分析结果表明:在多肽链中第207位氨基酸时,亲水性最高,为3.38;在肽链中第280位氨基酸时,疏水性最高,为-4.23,是疏水性蛋白.在青花菜E3泛素连接酶基因氨基酸序列中,其C、Y、S值均小于0.5,由此预测其不具有信号肽,不属于分泌蛋白.系统进化分析表明青花菜E3泛素连接酶基因与其他物种,比如拟南芥、草莓、月季、葡萄等苷核酸序列相似性都在60%以上,同甘蓝、油菜、白菜和拟南芥的进化关系较近,同草莓、月季、菜豆、葡萄、刺菜蓟、芝麻和水桔梗的进化关系较远,与其他物种,如拟南芥、草莓、月季、葡萄等核苷酸序列相似性都在60%以上.荧光定量PCR技术结果表明高温处理3 h时,青花菜E3泛素连接酶基因表达量下调30%,胁迫12 h时表达量持续下降仅为对照的20%.研究结果可为进一步深入探讨青花菜E3泛素连接酶的高温胁迫响应机制提供一定的理论依据.

姜柄瓜不同品种发芽期抗旱性鉴定及评价

为了探究姜柄瓜品种发芽期抗旱性的差异,筛选出抗旱品种.利用PEG-6000模拟干旱胁迫对姜柄瓜发芽期进行抗旱处理,测定其胚根长、胚轴长、鲜质量、发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数指标进行综合分析.结果发现,PEG质量分数越高抑制作用越强,在10%的PEG质量分数下,各项指标的变化总体最大,除发芽指数和活力指数在10%的PEG质量分数下差异不显著外,其余各指标差异均显著.使用10%的PEG质量分数处理不同的姜柄瓜,发现活力指数指标的变异系数最大为54%.所测品种当中,G11的发芽势指标和鲜质量指标最大,发芽率指标达到90%及以上的品种有G3、G7、G11、G13,G14和G11分别具有最大的胚根长和胚轴长,发芽指数在11~12之间的有G7、G11、G13和G16,活力指数测量值介于40~50的有G7、G11、G13、G14.胚根长与胚轴长、发芽指数与活力指数这两组指标的相关系数最高,r=0.986.隶属函数分析排在前5位的是G11、G14、G7、G13、G16,它们的各项指标都高于其他品种.所测品种的聚类分析分为4类,其中第4类为G13、G16、G11、G14、G7,共5份种质,其主要特征是发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、胚根长、胚轴长、鲜质量的测量值在这4类当中最高,属于抗旱型.综合来看,各项指标抗旱优异品种有G13、G16、G11、G14、G7,可作为优良抗旱种质.试验结果可为姜柄瓜抗旱育种提供一定的理论依据.

青花菜Ogu不育胞质分子鉴定和序列分析

雄性不育是农作物利用杂种优势、进行轮回选择和群体改良的重要手段,在农作物生产中具有巨大的利用价值。该研究为了鉴定青花菜细胞质雄性不育材料的不育胞质类型,以期今后为青花菜种质资源的收集、利用及分子标记辅助育种提供新的不育标记。根据Gen Bank中orf138基因保守序列设计特异引物,对20个青花菜种质资源基因组DNA进行PCR扩增。结果表明:特异引物P1/P2在12个青花菜雄性不育基因型中均扩增出392 bp的片段,在8个可育基因型中未扩增出条带,与田间育性鉴定结果相符。获得青花菜Ogu胞质雄性不育的特异基因orf138序列,Gen Bank中的登录号为HQ149728;用Blastn在Gen Bank中进行同源性比对分析,发现12个不育材料的特异片段与已报道的萝卜Ogu CMS所具有的Ogu orf138基因(Genbank登录号:Z18896.1)同源度高达100%。序列同源比对发现orf138基因存在变异位点。研究结果可为青花菜雄性不育细胞质的分子鉴定、进一步阐明胞质雄性不育败育机理,以及指导青花菜新型不育系的创建和杂种优势高效利用提供理论依据。

青花菜及其近缘种亲缘关系SRAP标记分析

利用SRAP分子标记技术,对青花菜与其近缘种进行遗传多样性分析。28对SRAP引物共产生302条谱带,其中多态性谱带203条,多态率为67.22%,表明种质间存在较高的多态性。相似系数分析表明,其变异范围为0.461 5-0.900 6,平均遗传相似系数为0.693 6。‘绿地’和‘矮抗青’之间的亲缘关系最远,遗传相似系数为0.461 5;‘Wzvcst-09-224’和‘Wzvcst-09-225’亲缘关系最近,遗传相似系数为0.900 6。聚类分析可将16个材料分为两大类,第Ⅰ类包括芸薹属甘蓝种蔬菜,第Ⅱ类为芸薹属白菜种。揭示了青花菜及其近缘变种间具有部分相似的遗传基础,亲缘关系较近。结果表明,同一地域或来源的材料间具有较为相近的遗传背景,亲缘关系相对较近。研究结果有助于青花菜与其近缘种间种质资源分类和优异基因利用,加速青花菜新品种选育进程。

青花菜花粉发育基因MF21的克隆及表达特征分析

从青花菜自交系‘WN12-95B’中克隆得到花粉发育基因MF21。序列生物信息学分析表明,该基因全长468 bp,编码151个氨基酸,相对分子量为16.70 kD,等电点为8.56,为疏水性蛋白。青花菜MF21蛋白的信号肽长度为22个氨基酸残基。且该蛋白含有两个蛋白激酶C磷酸化位点,4个N端豆蔻酰化位点和一个酪氨酸磷酸化位点。不规则卷曲和β-转角是其二级结构主要构成成分。分子进化表明,MF21基因与同属的埃塞俄比亚芥进化关系最近。通过荧光定量PCR对青花菜MF21基因的时空表达特性进行分析,结果表明该基因在保持系花蕾中表达较高,具有明显的组织特异性。在Ogu不育系及其保持系不同发育阶段的花蕾中MF21相对表达量差异明显。

花椰菜种质资源遗传多样性SRAP标记分析

为了从分子水平上揭示花椰菜种质资源间的亲缘关系,为其种质搜集、鉴定、利用和遗传改良提供一定的理论基础。本研究采用SRAP分子标记技术对24份花椰菜种质资源进行遗传多样性研究。从30个引物组合中筛选得到23对多态性引物组合,共检测到257条扩增条带,平均每对引物扩增等位基因数从5到20不等。其中多态性片段为185条,多态性比例为71.98%,表明花椰菜种质间具有相对丰富的遗传多样性。相似系数分析表明种质间遗传相似系数为0.5491～0.9626,平均为0.7490。SRAP分子标记聚类分析结果显示来源和地域可作为花椰菜种质聚类的农性状之一。

青花菜早中熟种质资源遗传多样性SRAP标记分析

采用SRAP分子标记技术对12份青花菜早中熟种质资源进行遗传多样性分析。从48个引物组合中筛选得到28对多态性较好的引物组合，共检测到312条扩增条带，每个引物组合产生2至22个不等的条带，其中多态性片段为227条，多态性比例为75．76％，揭示所选青花菜种质资源间具有较为丰富的遗传多样性。相似系数分析表明种质间遗传相似系数为0．6506～0．8782，平均为0．7862。聚类分析结果显示熟性和来源可作为青花菜早中熟种质聚类的重要农艺性状之一。

青花菜肉桂酰辅酶A还原酶基因的克隆与表达特征分析

为研究肉桂酰辅酶A还原酶在青花菜生长发育中的作用,采用RT-PCR技术克隆青花菜Bo CCR基因全长c DNA序列,并利用q RT-PCR检测其在不同器官中的表达模式。结果表明:Bo CCR基因开放阅读框为987 bp,推导编码328个氨基酸。预测蛋白分子量为36.86 ku,PI值为6.04。该蛋白亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸,为亲水性蛋白。高级结构预测表明青花菜Bo CCR蛋白具有完整的二级结构,三级结构的α-螺旋主要位于外部,β-折叠位于内部。分子进化分析显示CCR蛋白在植物进化过程中,各属形成单独的分枝,可以区分其亲缘关系。荧光定量技术检测到青花菜的Bo CCR基因在花蕾发育早期表达最高,推测该基因可能与青花菜花粉发育相关。

辣椒actin基因电子克隆与生物信息学分析

利用拟南芥actin基因序列为探针,采用电子克隆方法获得辣椒actin基因cDNA序列,对其编码氨基酸序列组成、理化性质、二级结构特点进行分析,并与其他植物actin的进化关系进行了研究。结果表明,辣椒actin基因cDNA全长为1 865 bp,包含1个完整的开放读码框(1 134 bp),编码377个氨基酸,其分子量为41 700.6 u,等电点为5.31,为亲水蛋白。辣椒actin与拟南芥actin2同源性为99.0%,进化关系上与番茄actin97亲缘关系较近。

青花菜BoSCL3基因的克隆和渍水胁迫下的表达特征分析

为了解SCL3(scarecrow-like 3)基因的功能,从青花菜(Brassica olreacea var.italica)中克隆得到1个SCL3基因,命名为BoSCL3,其cDNA全长1355 bp,编码446个氨基酸。BoSCL3分子量为49.96 kD,为疏水性蛋白,与油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)中SCL3蛋白的亲缘关系最近,同科植物的SCL3具有较高的同源性。荧光定量PCR分析结果表明,青花菜BoSCL3基因表达量随渍水胁迫时间延长先下降后上升,推测其可能参与渍水胁迫响应。这为探讨青花菜BoSCL3基因响应渍水胁迫的分子机制提供理论依据。

中国南瓜蔗糖转化酶(INV)基因的鉴定及进化和表达分析

蔗糖转化酶(INV)编码基因广泛参与植物的生长发育,在果实成熟期可影响果实品质。本研究利用生物信息学手段对中国南瓜INV基因家族进行鉴定和分析。结果表明,从中国南瓜中鉴定出18个INV基因家族成员,其功能分为酸性转化酶和中性/碱性转化酶两大类。该家族成员在11条染色体上不均匀分布,且仅有1对串联重复基因。表达模式分析结果显示,CmoCh06G004890.1在根中的相对表达量高于其他INV基因家族成员,CmoCh01G010160.1和CmoCh06G004890.1在果实中的相对表达量较高。葫芦科作物INV系统进化分析结果表明,中国南瓜、印度南瓜和美洲南瓜的大多数INV基因均聚为一簇,具有较近的亲缘关系。本研究结果为进一步分析中国南瓜INV基因的生物学功能以及提高中国南瓜品质提供了一定的理论依据。

青花菜BoDof5.3基因的克隆及渍水胁迫表达特征分析

从青花菜中克隆得到一个Dof基因,命名为BoDof5.3。序列分析结果表明:该基因ORF全长774 bp,编码257个氨基酸,编码的蛋白质为亲水性蛋白质。青花菜BoDof5.3蛋白具有典型的Zf-Dof结构域,其二级结构以无规则卷曲为主。系统进化分析结果表明,青花菜BoDof5.3蛋白与甘蓝、花椰菜Dof蛋白亲缘关系最近,在进化树上聚为一组,同属植物的Dof蛋白具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析结果显示,在渍水胁迫0 d到2 d时,BoDof5.3基因表达量呈下降趋势,6 d时表达量升高为对照的1.3倍,推测该基因可能参与青花菜渍水胁迫的响应。

青花菜细胞质雄性不育相关miRNA的鉴定与表达特征分析

植物miRNA是一类内源小分子RNA,在花粉发育和育性调控中具有重要作用。该研究利用高通量测序技术构建了青花菜细胞质雄性不育系及其保持系花蕾的sRNA文库,并通过qRT-PCR技术检测育性相关的miRNAs及其预测靶基因的表达特征,为深入探讨miRNA调控青花菜育性机制提供理论依据。结果表明:(1)在青花菜中共鉴定到181个保守miRNA和8个新型miRNA,差异表达miRNA共47个,其中24个已知miRNAs和4个新型miRNAs表达上调,其余为表达下调;发现2个差异miRNA只在不育系中表达,7个差异miRNA为保持系所特有。(2)生物信息学分析表明,共鉴定到2个关联的miRNA-mRNA对[miR859-1靶向的花粉外壁蛋白基因(T2/Unigene_BMK.21608)和miR5174e-1调控的氨基酸通透酶基因(T2_Unigene_BMK.31772)],2个miRNA均负向调控相应的靶基因,均可参与青花菜小孢子发育以及雄性不育的发生过程。(3)qRT-PCR分析显示,miR159a-1、miR164a-1、miR319a-1和miRn11在青花菜不育系中的表达量高于其保持系,其中miR164a-1、miR319a-1和miRn11的表达水平随着花蕾的发育不育系逐渐降低,而在保持系的表达呈上升趋势;miR319a-1和miR397a-2在雄蕊中的表达量高,而在其他部位的表达量较低,且miR397a-2在青花菜不育系中的表达量显著低于保持系。研究推测,miRNA可能是通过抑制雄性不育相关的PPR基因表达、调控LAC基因的表达以及调节激素和Ca^(2+)介导的信号转导通路等,从而导致青花菜雄性不育的发生。

青花菜高温和盐胁迫相关LncRNAs的鉴定与表达特征分析

为探讨长链非编码RNA在青花菜高温和盐胁迫中的功能。以青花菜高代自交系‘WN12-95B’为试验材料,通过RNA-seq测序、靶基因注释和qRT-PCR分析,筛选出与青花菜高温和盐胁迫相关的LncRNA。在青花菜高温和盐胁迫文库中鉴定到2432条LncRNAs,筛选获得158个差异LncRNAs,其中96个上调表达,62个下调表达。序列特征分析发现LncRNAs的长度较mRNA短,外显子个数也比mRNA少。靶基因注释显示差异LncRNAs可通过谷胱甘肽代谢、信号转导以及氧化磷酸化等参与青花菜高温和盐胁迫响应。qRT-PCR分析结果显示10个挑选的差异LncRNAs在盐胁迫和高温胁迫中的表达趋势各具特点。XLOC_033957、XLOC_034964、XLOC_005515、XLOC_027154、XLOC_023592和XLOC_035830在高温胁迫下呈现先下降再上升的模式,但在盐胁迫中其表达模式存在差异。XLOC_033671、XLOC_003826、XLOC_06988和XLOC_024730在盐胁迫下呈持续上调表达,在高温胁迫下先上升后下降。通过测序及数据分析,鉴定出青花菜高温和盐胁迫相关的LncRNA的相关基因,为进一步分析LncRNAs在青花菜高温和盐胁迫下的调控机制提供一定的基础。

青花菜细胞质雄性不育相关LncRNAs的鉴定与表达分析

细胞质雄性不育系的应用可有效提高杂交种质量。该研究利用illumina测序技术鉴定青花菜细胞质雄性不育相关LncRNAs,对其靶基因和表达特征进行分析,并随机选取16个LncRNAs用qRT-PCR技术检测其表达特征,为进一步阐明LncRNA参与青花菜雄性不育发生机制提供新的路径。结果表明:(1)鉴定获得青花菜雄性不育相关LncRNAs共4326个,其中37个LncRNA在不育系及其保持系中差异表达。(2)差异LncRNAs可预测得到370个cis靶基因,这些靶基因部分为雄性不育相关的转录因子和生物蛋白。(3)XLOC_006651、XLOC_016660、XLOC_003494和XLOC_013121在不育系和保持系花蕾发育早期表达量较高,之后随着花蕾的发育,表达量逐渐下降;XLOC_021769和XLOC_038964呈先降后升的表达模式,且XLOC_038964和XLOC_012613在花蕾不同发育阶段不育系的表达量均高于保持系。(4)16个LncRNA均可在花梗、花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊中表达,且XLOC_038964、XLOC_011575、XLOC_013157、XLOC_039677、XLOC_037356、XLOC_034182和XLOC_017574呈现出相似的表达模式,在雄蕊和花梗中表达量较低,花萼和花瓣中较高,雌蕊中表达量最高。