两个华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶的基因克隆、表达与定性(英文)

目的 寻找对华支睾吸虫病诊断有效的抗原基因,以便生物合成并研究其应用价值。方法 选取两个Genbank已报告的基因序列AF271091(CysA)及AF093242(CysB)分别克隆与表达融合蛋白,亲和层析纯化后进行免疫定性。结果 CysA与CysB均获得成功克隆与表达,Western blot分析显示CysA与华支睾吸虫病阳性血清有强反应,与日本血吸虫病阳性血清只有很弱的交叉反应,而CysA与华支睾吸虫感染血清无反应。免疫组化显示,被表达的两个半胱氨酸蛋白酶在华支睾吸虫体内的免疫定位无显著不同,主要在成虫肠道及虫卵。结论 成功表达的两个半胱氨酸蛋白酶中,CysB针对华支睾吸虫病血清有良好的抗原活性,值得视为诊断抗原候选做进一步的研究。

华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶用于血清学调查的效果评价

目的以华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶(CsCp)为ELISA包被抗原检测流行人群血清特异性抗体水平,与成虫粗抗原比较,评价其用于华支睾吸虫病血清学调查的价值。方法以佛山市南海区的1个行政村为调查点,用改良加藤厚涂片法检查粪便华支睾吸虫虫卵。同时采集血清,分别以rCsCP与成虫粗抗原(CsCAA)的ELISA方法检测血清特异性抗体水平,对粪检及两种抗原的ELISA结果进行统计学分析。结果接受血清检测的97人中,华支睾吸虫虫卵阳性率60.8%,CsCAA-ELISA阳性率75.3%,rCsCP-ELISA阳性率76.3%,特异性抗体阳性率高于虫卵阳性率(P<0.05),不同抗原ELISA阳性率差异无统计学意义(P>0.05);CsCAA-ELISA、rCsCP-ELISA结果与粪检结果的符合率分别为56.7%和55.7%,两种抗原ELISA结果的符合率为82.5%。59例粪检阳性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率均为76.3%,38例粪检阴性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率分别为73.7%和76.3%。结论以rCsCP为包被抗原,用ELISA检测华支睾吸虫病流行区人群血清特异性IgG抗体与使用CsCAA的检测结果有较高的符合率,但同样不能区分现症与既往感染。

重组抗原应用于SPG-ELISA检测华支睾吸虫循环抗体的效果评价

目的评价重组抗原用于SPG-ELISA诊断华支睾吸虫感染的价值。方法分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(Cs-CysB)与华支睾吸虫成虫可溶性抗原(CAA),以SPG-ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG,比较两种抗原包被SPG-ELISA方法的敏感性与特异性。结果检测50份华支睾吸虫感染者血清,重组Cs-CysB与CAA包被的SPG-ELISA阳性率均为94.00%,健康人血清50例均为阴性;检测日本血吸虫病血清20份、并殖吸虫病血清20份、囊虫病血清10份,交叉反应率分别为5.00%、10.00%、20.00%和5.00%、0、20.00%。结论以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性,检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当。

广东省三文鱼淡水寄生虫感染情况调查与分析

目的对广东省养殖及市售各环节三文鱼(本文泛指鲑科鱼类)的淡水寄生虫感染状况进行调查,分析广东省居民生食三文鱼感染淡水寄生虫的风险。方法在广州、深圳及佛山市的市售环节共采集三文鱼生155份;在广东省2个养殖场、青海省1个养殖场共采集鳟鱼肉样品84份并对养殖场进行环境卫生调查。对采集的三文鱼肉样品,用酶消化法检测致病性淡水寄生虫。采用SPSS20.0软件进行统计学分析。结果采自养殖、流通及餐饮环节的三文鱼样品共239份,使用酶消化法均未检出华支睾吸虫囊蚴等致病性寄生虫。养殖环境调查显示,3家养殖场环境总体良好,均无人为的粪便污染渠道,其中1家周边可见猫、狗自由出入。结论目前广东省生食三文鱼淡水寄生虫感染风险较低,但仍需持续开展监测及相关研究工作,掌握淡水三文鱼养殖及消费的远期寄生虫感染风险;通过推广三文鱼规范化养殖和鱼生冷冻灭虫处理、加强养殖卫生监管以及饮食卫生宣教等措施,最大程度降低生食三文鱼淡水寄生虫感染风险。

ABC-ELISA法检测华支睾吸虫特异性IgG及其亚类

目的 研究ABC ELISA法检测IgG及IgG亚类用于华支睾吸虫病诊断的价值。 方法 采用ABC ELISA法检测华支睾吸虫感染者 (62例 )和健康人 (3 8例 )血清特异性总IgG及其亚类。 结果 华支睾吸虫感染者血清特异性总IgG及其亚类阳性检出率分别为IgG 10 0 % (62 / 62 ) ,IgG15 4.8% (3 4/ 62 ) ,IgG2 79.0 % (4 9/ 62 ) ,IgG3 40 .3 % (2 5 /62 ) ,IgG498.4% (61/ 62 ) ;其中IgG4平均阳性滴度显著高于总IgG (P <0 .0 1)。健康人血清特异性总IgG假阳性率7.9% (3 / 3 8) ,IgG4假阳性率为 0 ;检测健康对照血清IgG4的A值 (0 .0 0 1)显著低于总IgG检测 (A =0 .0 3 1) (P <0 .0 1)。 结论 ABC ELISA法用于华支睾吸虫病诊断具有较高的敏感性 ;检测特异性IgG4诊断华支睾吸虫病效能与检测总IgG相当 ,同时具有阳性显色强、阴性本底低的优点 ;其余IgG亚类对于华支睾吸虫病诊断价值不大。

华支睾吸虫成虫总RNA的一步法提取与纯化

目的 为华支睾吸虫cDNA文库的构建提供基础。方法 采用硫氰酸胍 -酚 -氯仿一步法提取华支睾吸虫成虫总RNA。结果与结论 3 .5h左右可自华支睾吸虫成虫获得高纯度、完整性好的RNA。其总RNA存在体内缺口现象 ,2 8s电泳主带缺如。

ELISA检测广东省各地鼠形动物SARS特异性抗体的初步研究

目的 了解广东省各地鼠形动物血清SARS冠状病毒特异性IgG抗体水平 ,为探讨鼠形动物尤其是家鼠类媒介生物 ,与SARS流行是否存在相关性提供参考。方法 在广东省各地与SARS相关或被认为可能相关的场所诱捕鼠形动物 ,留取血清 ,用葡萄球菌A蛋白 酶联免疫吸附实验 (SPA ELISA)及常规ELISA检测SARS冠状病毒特异性IgG抗体水平。 结果 在广东省各地共获取鼠形动物 (包括褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠及臭 )血清 193份 ,用SPA ELISA检测 ,7份特异性抗体阳性 ,均为褐家鼠或黄胸鼠 ,阳性率 3 .6% ;其中 13 9份褐家鼠、黄胸鼠血清用常规ELISA重复检测 ,检出阳性 18份 ,阳性率 12 .9% ;SPA ELISA检测阳性者中 5份用常规法复检 ,4份仍为阳性 ;所有阳性者均来自广州、佛山、深圳 3地。结论 在广东省各地捕获的鼠形动物中 ,血清SARS冠状病毒特异性IgG抗体阳性者均为褐家鼠或黄胸鼠 ,阳性者的地域分布似乎与广东省SARS流行情况存在一定的相关性 ;SPA ELISA法检测Rats类家鼠血清SARS冠状病毒特异性IgG的敏感性可能低于常规ELISA法 ,而检测阳性者与SARS冠状病毒接触或感染的相关程度还需进一步的研究证明。

华支睾吸虫病诊断抗原研究进展

随着华支睾吸虫病防治工作的进展，其患病率及感染度逐步下降，而诊断的难度渐趋加大，原主要诊断方法粪检固有的缺陷愈加突出，免疫学诊断在临床辅助诊断和疫区流行病学调查中占据愈来愈重要的地位。诊断抗原的优劣决定着血清抗体检测、皮肤试验等免疫学方法的诊断效果。...

链球菌蛋白G-ELISA用于华支睾吸虫病诊断的方法初探

目的评价链球菌蛋白G-ELISA法在华支睾吸虫病诊断上的价值。方法重组链球菌G蛋白用于快速酶联免疫吸附试验(ELISA)检测华支睾吸虫病患者、其他寄生虫感染者(日本血吸虫病、肺吸虫病、囊虫病)和健康人血清特异性IgG抗体。结果华支睾吸虫病患者血清特异性IgG的阳性检出率为94%(47/50),健康人血清的阴性率为100%(50/50)。检测日本血吸虫病血清、肺吸虫病血清及囊虫病血清,交叉反应率分别为5%(1/20)、0(0/20)、20%(2/10)。检测健康人及其他寄生虫感染者的总阴性率为97%(97/100)。结论链球菌蛋白G-ELISA用于华支睾吸虫病血清学诊断具有较高的敏感性及特异性。

日本血吸虫成虫31/32kD蛋白对免疫小鼠TNF-α及sIL-2R影响的研究

为了研究Ｓｊ３１／３２所诱导的保护性免疫机制，探讨细胞因子ＴＮＦ－α及ＩＬ－２与Ｓｊ３１／３２保护力之间的关系，本实验用纯化的Ｓｊ３１／３２免疫小鼠，攻击感染后每隔２ｗｋ取外周血观察ＴＮＦ－α与ｓＩＬ－２Ｒ水平的动态变化。结果表明，Ｓｊ３１／３２可影响宿主ＴＮＦ－α与ＩＬ－２水平的表达。由此推测，Ｓｊ３１／３２的保护性免疫机制可能与宿主体内ＴＮＦ－α及ＩＬ－２水平的变化有关。

华支睾吸虫15/16ku蛋白的纯化与部分氨基酸顺序测定

目的 进一步证明华支睾吸虫成虫 15 / 16 ku蛋白 (Cs15 / 16 )用于诊断的免疫活性 ,同时测定其部分氨基酸顺序 ,便于今后对此蛋白的人工合成等分子生物学研究及其相关免疫学研究。 方法 用高效液相色谱技术 (HPL C)自华支睾吸虫粗抗原 (Clonorchis sinensis adultworm antigens,CAA)中提纯 15 / 16 ku蛋白 ,用酶联免疫吸附实验 (EL ISA)测定其抗原活性 ,并使用蛋白质自动测序仪测定其 N端部分氨基酸顺序。 结果 3个具有抗原活性的纯化样品 (H3、H11及H13)中 ,H13的诊断效果接近 CAA,敏感性达 90 % ,特异性 95 %。分别测获 3个纯样的 N端 15、14和 2 0个氨基酸残基 (aa) ,其中 H11的 N端 14个 aa与 H13的前 14个完全相同。 结论 进一步证明了 Cs15 / 16为有效的诊断抗原 ,测获的部分氨基酸顺序可为更深入的研究提供参考。

华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因的分子表达、蛋白纯化与定性

目的选取一个华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因进行克隆表达、纯化,并鉴定该重组蛋白的分子特性及潜在的诊断应用价值。方法根据Genbank中华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因顺序(L47982)设计引物,从华支睾吸虫成虫cDNA扩增特异性片段,与pTrcHis表达载体连接,重组质粒在大肠埃希菌DH5α中表达,使用亲合层析柱纯化重组蛋白。分别使用SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定重组蛋白的一般分子特性和抗原活性,以免疫组化染色法探讨该抗原在成虫组织内的分布。结果重组质粒在大肠埃希菌中成功表达,亲合层析获得高纯度的磷酸甘油酸激酶融合蛋白(rCsPGK),分子量约4.7×104。Western blot显示该重组抗原与华支睾吸虫感染阳性血清有较好的结合反应。ELISA结果显示,rCsPGK用于检测特异性抗体在数值上可区分阴阳性血清,受检阳性与混合阴性血清A值之比(P/N)为1.22～1.86,明显低于使用全虫粗抗原的P/N值(4.24～8.21)。免疫组化显示,针对rCsPGK的抗体与成虫体壁的上皮组织、卵黄腺及卵巢内虫卵有明显的染色反应。结论该研究用pTrcHis原核表达系统成功克隆和表达了华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶融合蛋白。使用亲合层析能获得高纯度、具有潜在诊断应用价值的rCsPGK抗原,但用于检测特异性抗体的敏感性低于全虫粗抗原。免疫组化表明,华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶可能主要分布在成虫体壁的上皮组织、卵黄腺及卵巢内虫卵等组织内。

HPLC与制备电泳技术对部分华支睾吸虫抗原的提纯与活性比较

目的 筛选并纯化出单一有效的华支睾吸虫病诊断抗原，以利于对诊断抗原进一步的分子生物学研究。方法 分别应用高效液相色谱（ＨＰＩＣ）与制备电泳技术对华支睾吸虫全虫粗抗原（ＣＡＡ）中部分蛋白组分进行纯化，并用酶联免疫吸附实验（ＥＬＬＳＡ）测定其用于诊断的抗原活性。结果以ＨＰＬＣ法分离出１５／１６ｋＤａ与３５／３６ｋＤａ纯抗原蛋白，部分１５／１６ｋＤａ蛋白样品抗原活性接近ＣＡＡ，敏感性达９０％，特异性９５％。制备型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法分离出１５／１６ｋＤａ纯抗原蛋白，抗原活性低，敏感性１０％～６０％，特异性９５％。结论 高效液相离子交换色谱法可纯化出高活性抗原成份，优于制备电泳纯化；部分华支睾吸虫成虫１５／１６ｋＤａ蛋白成份为有效诊断抗原，可以替代ＣＡＡ用于华支睾吸虫病的血清学诊断。

广东省广州管圆线虫病疫源地调查

目的了解广东省广州管圆线虫病疫源地分布情况,为制定监测方案提供依据。方法按不同地理位置分层抽样,分别抽取粤东、粤西、粤北山区和珠江三角洲4个地区共22个县(市、区),每县(市、区)随机抽取1～2个行政村(区)作为调查点。用匀浆法或肺检法剖检在野外现场采集的部分小管福寿螺(Pomacea canaliculata)和褐云玛瑙螺(Achatina fulica),以及餐饮、集市采集的不同品种的淡水螺和陆生螺,调查广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonen-sis)Ⅲ期幼虫感染情况。现场捕捉鼠类,鉴别种类后解剖心肺组织,检查感染情况;采集新鲜鼠粪,用清水沉淀法检查幼虫。结果22个调查县(市、区)均有小管福寿螺分布,且数量众多;广宁县未开展褐云玛瑙螺调查,和平县、曲江区和翁源县未采集到褐云玛瑙螺,其他调查点均有该螺分布。22个调查县(市、区)共采集小管福寿螺3754只,褐云玛瑙螺1465只,平均感染率分别为5.9%(172/2929)和16.5%(223/1354),两者差异有统计学意义(P<0.01)。粤东、粤西、粤北山区和珠江三角洲的受检螺平均感染率有地区差异(P<0.01),珠江三角洲最高(15.6%,152/975),其中又以东莞市的受检螺平均感染率最高(34.7%,78/225)。在9个调查县(市、区)的农贸市场采集圆田螺(Cipangopaludina)114只和环棱螺(Bellamya)541只,罗定市和开平市的环棱螺中幼虫阳性率分别为1.4%(1/70)和3.3%(3/91)。在9个调查县(市、区)捕获褐家鼠(Rattus norvegicus)、黄胸鼠(R.flavipectus)、鼩鼱(Suncus murinus)、小家鼠(Musmus-culus)、大板齿鼠(Bandicota indica)、黄毛鼠(R.losea)和黑家鼠(R.rattus)等共491只,平均感染率为11.4%(56/491),其中褐家鼠、黄胸鼠和板齿鼠的平均感染率分别为19.8%(52/263),2.5%(3/118)和10.0%(1/10),其他4种鼠类中均未发现有广州管圆线虫感染。在7个调查县(市、区)采集到新鲜鼠粪34份,Ⅰ期幼虫阳性率为44.1%(15/34)。结论广东省广州管圆线虫病疫源地分布广泛,中间宿主和终末宿主均有不同程度感染。

广东省啮齿类感染广州管圆线虫的调查

目的调查广东省啮齿类感染广州管圆线虫现状，为制定广州管圆线虫病的防控策略提供科学依据。方法2005—2010年在广东省的粤东、粤西、粤北山区和粤中珠江三角洲等4个地域28个县（市，区）28个乡（镇）56个村（街道），采用笼捕法捕鼠，进行分类鉴定，剖检鼠类动物的心、肺，查找广州管圆线虫成虫，计算感染率和感染度，并鉴定雌雄成虫。结果共捕获鼠类动物2目2科（亚科）4属10种，其中7种鼠类感染广州管圆线虫。28个县（市／区）调查点捕获的鼠类均发现感染有广州管圆线虫。共剖检鼠类5820只，总感染率为8．5％（49615820），平均感染度为6．1条／鼠。所调查的4个地域，以珠江三角洲的鼠类感染率最高，为9．8％（205／2084）（冉15．25，P〈0．01）；所捕获的鼠类中，以褐家鼠的感染率最高，为16．9％（310／1835）（x^2=-240．91，P〈0．01）；检获的广州管圆线虫雌虫1125条，雄虫1064条，两者差异无统计学意义（x^2=1．75，P〉0．05）。结论广东省的粤东、粤西、粤北山区和粤中珠江三角洲等4个地域28个县（市，区）28个乡（镇）56个村（街道）调查点的鼠类动物均有广州管圆线虫感染。

华支睾吸虫重组蛋白应用于ABC-ELISA检测特异性循环抗体的研究

目的评价重组蛋白在华支睾吸虫病诊断上的价值,探索以重组蛋白替代天然抗原用于ELISA等血清学方法诊断华支睾吸虫感染的可能性。方法分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶(CysB)与华支睾吸虫成虫可溶性抗原(CAA),以ABC-ELISA检测华支睾吸虫病、其它寄生虫感染及健康人血清特异性IgG,比较两种抗原用于检测的敏感性与特异性。结果共检测了112份华支睾吸虫感染血清,使用重组抗原CysB与成虫粗抗原CAA的阳性检出率分别为92.9%(104/112)及94.6%(106/112);分别检测健康人血清56例、日本血吸虫病血清20例及肺吸虫病血清10例,对于两种抗原,华支睾吸虫特异性IgG检测阴性率均相同,上述三类血清的阴性率分别为96.5%(54/56)、95%(19/20)及90%(9/10)。结论华支睾吸虫重组蛋白CysB用于血清特异性抗体检测具有较高的敏感性及特异性,与成虫可溶性抗原(CAA)的诊断应用价值相近,有望成为应用于华支睾吸虫病诊断的替代抗原之一。

华支睾吸虫cDNA文库的构建

目的 构建华支睾吸虫cDNA文库。方法 采集华支睾吸虫阳性鱼 ,分离囊蚴 ,感染实验动物兔 ,解剖兔收集华支睾吸虫成虫虫体。应用“一步法”提取华支睾吸虫总RNA ;经过mRNA纯化、cDNA合成 ,以PcDNA3(Amp +)质粒为载体构建文库。挑取 2 0个克隆进行扩增 ,选择 9个克隆进行DNA序列测定。序列结果与GenBank中相关基因进行比对。结果 获得含有 9 7× 10 5个重组子库容量的华支睾吸虫cDNA文库。其中PC6号克隆基因序列与华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列具有 93%的同源性。结论 已构建成华支睾吸虫cDNA文库。

RT-PCR检测病媒生物SARS冠状病毒结果初报

目的 调查广东重点地区鼠类和蜚蠊是否携带SARS冠状病毒或者是否SARS冠状病毒的宿主 ,为寻找SARS冠状病毒的来源及控制SARS流行提供依据。方法 巢式RT -PCR技术、荧光定量RT -PCR技术。结果 利用SARS冠状病毒特异性引物对广州、中山、江门及恩平等地的 160份鼠肺样品及 15份蜚蠊的体表擦拭子检测结果表明 ,荧光定量RT -PCR未检测到阳性 ,巢式RT -PCR显示来自广州市的 1份蜚蠊体表擦拭子呈可疑阳性。结论 巢式RT -PCR、荧光定量RT -PCR都适合于病媒生物SARS冠状病毒的初步筛选 ,目前未有明显证据显示鼠类及蜚蠊携带和传播SARS冠状病毒 ,仍需作进一步研究。

广东省首次广州管圆线虫感染局部暴发的流行病学调查

目的了解一起外来民工集体感染广州管圆线虫疫情的流行因素。方法对广宁县文坑村疑似广州管圆线虫感染的云南白族民工、其他民工和当地居民进行现场流行病学调查;采集疑似病人和部分民工血清检测广州管圆线虫抗体;在疫点及周围捕捉老鼠,采集福寿螺、东风螺和新鲜鼠粪进行病原学检查。结果2007年3月24日17名云南白族民工共同进食在居住地附近的田地里采集的福寿螺,其中先后有6人发病,罹患率为35.29%(6/17),全部患者均进食过生螺肉。仅捕获黄胸鼠1只,未发现广州管圆线虫感染;采集新鲜鼠粪8份,其广州管圆线虫感染率为75%(6/8)。检查福寿螺189只,平均感染率为2.12%(4/189),感染度为平均每只螺含37条广州管圆线虫幼虫,其中大福寿螺的感染率较高,为21.43%(3/14);未采集到东风螺。采集5份患者和2份无症状民工的血清,其中2份患者血清的广州管圆线虫抗体呈弱阳性。结论广宁县横山镇文坑村是广州管圆线虫病的重要自然疫源地。外来民工同吃生福寿螺是引起广州管圆线虫感染局部暴发的主要因素。

广东省广州管圆线虫病自然疫源地调查

目的了解广东省广州管圆线虫病自然疫源地分布情况，为制定监测方案提供科学依据。方法按不同地理位置分层抽样方法，分别抽取粤东、粤西、粤北、珠江三角洲共17个县（市），每县（市）随机抽取1-2个行政村（区）作为调查点。在野外现场采集不同品种的淡水螺和陆生螺，用匀浆法和肺检查法解剖调查广州管圆线虫感染情况；捕捉老鼠，解剖心肺组织检查其成虫；以及采集新鲜鼠粪用清水沉淀法进行病原学检查。结果17个调查县（市）中，各地均有福寿螺分布，且数量众多；广宁县没有开展褐云玛瑙螺的调查，除河源和平县和韶关曲江区没有采集到褐云玛瑙螺外，其余地方都有褐云玛瑙螺分布。17个点共采集福寿螺、褐云玛瑙螺3329只，除徐闻县外罗镇未发现有广州管圆线虫感染的螺外，其余16个点采集的螺中均发现有自然感染的广州管圆线虫，平均感染率为6．64％（221／3329）。福寿螺感染率南澳县最高，为17.58％（29／165），褐云玛瑙螺感染率花都区最高，为43.75％（7／16）；梅县受检螺平均感染率最高，为17.45％（41／235）。各地褐云玛瑙螺的感染率和感染度远高于福寿螺。在5个调查点的农贸市场购买圆田螺89只和石螺252只中，仅有罗定县的1只石螺检测到阳性，阳性率为1．43％（1／70）。在6个调查点捕捉到褐家鼠（27只）、韵黯（5只）、小家鼠（2只）、黄胸鼠（3只）和田鼠（3只）共40只，其中和平县、雷州市和中山市捕捉到的褐家鼠中各有1只检出广州管圆线虫成虫，阳性率为11．11％（3／27）。在7个调查点采集到新鲜鼠粪34份，阳性率为44．12％（15／34）。结论广东省广州管圆线虫病自然疫源地分布广泛，除粤北部分山区未发现有褐云玛瑙螺分布以外，其余地区均有福寿螺和褐云玛瑙螺分布，广州管圆线虫中间宿主和终末宿主有不同程度感染。