基于全基因组鉴定华石斛优良内参基因

华石斛是海南岛特有的热带兰科植物,具有很高的观赏和药用价值。然而,未确定的内参基因限制了该物种基因表达分析。本研究利用之前华石斛转录组数据,筛选出164个变异系数低(CV≤0.2)和表达量中等(TPM在10~300之间)的候选内参基因。为了避免共表达现象对内参基因稳定性分析的影响,根据GO功能聚类分析结果,从不同的功能群中共筛选出24个候选基因。为避免模板中可能残留的基因组DNA在RT-qPCR扩增过程中产生假阳性,本研究设计了跨越内含子引物,并通过电泳筛选出符合要求的15个候选内参基因的扩增引物。为了确保RT-qPCR扩增的特异性,使用LightCycler 96进行熔解曲线分析。依据15个候选基因的RT-qPCR数据,同时综合多个算法分析,在干旱胁迫下,不同软件分别确定CLP1&SEC23、SEC23&CPY71、CLP1&SEC23和RNG1L&PECT为最佳内参基因,综合排序后选取SEC23和CLP1为华石斛干旱胁迫下最稳定内参基因。在华石斛不同组织中,不同软件分别确定了ADF11&IBR5、PRP19&CLP1、ADF11&CLP1、ACBP2&IBR5为最佳内参基因,综合分析后确定ADF11和ACBP2为不同组织中最稳定内参基因。结合上述干旱胁迫和不同组织分析数据,最终确定IBR5和CPY71为综合条件下较稳定的内参基因。内参基因验证表明,与传统的Actin内参相比,本研究筛选出的内参基因可获得更为精确的RT-qPCR校准结果,表明所筛选的内参基因具有极高的稳定性。综上所述,本研究为利用转录组数据鉴定稳定内参基因提供思路,首次在华石斛全基因组范围内鉴定稳定内参基因,为进一步研究基因表达和功能奠定基础。