桑树miR858及MYB转录因子基因在桑椹花青素合成过程中的表达分析

为探究桑树miR858及其靶向MYB转录因子基因调控桑椹花青素合成的分子机制,利用生物信息学、5′-RACE及qRT-PCR技术进行分析,使用在线网站预测,发现在桑树MYB基因家族中存在9个miR858靶基因,均为R2R3-MYB型基因,其中6个在降解组测序结果中能够被miR858靶向切割;5′-RACE技术对MYB5-1进行验证,发现切割位点位于与miRNA互补序列的第11至第12位碱基之间。对靶基因互补区进行分析发现miR858靶向区域为R3结构域中的T区,该区域核苷酸序列在第3、6、12、15、18位存在差异,但氨基酸序列一致,其切割位点具有保守性。运用Pearson对MYB与花青素合成关键基因表达进行相关性分析,发现MYB与花青素合成关键基因存在显著相关。qRT-PCR分析结果表明,miR858在黑、白桑椹的3个发育阶段表达上升,而MYB5-1基因在黑、白桑椹中的表达水平均呈现下降的趋势,二者呈现相反的表达趋势。由此推测,miR858可能通过抑制MYB5-1的表达从而调控桑椹花青素合成。本研究确定了桑树中MYB5-1为miR858作用的靶基因之一,分析了MYB5-1与花青素合成关键基因的相关性,从分子角度探究桑树miR858及靶基因MYB在桑椹花青素合成过程中的调控机制,为进一步探索桑椹花青素合成以及代谢过程提供相关数据支持。

TRIM28siRNA抑制非小细胞肺癌A549裸鼠移植瘤生长以及促进凋亡的研究

目的建立非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549细胞裸鼠移植瘤模型,探讨TRIM28小干扰RNA(siRNA)对NSCLC裸鼠移植瘤生长和细胞凋亡的影响。方法将NSCLC细胞A549皮下注射Balb/c裸鼠建立移植瘤模型。比较皮下注射A549/TRIM28siRNA细胞和A549/ControlsiRNA细胞的两组裸鼠移植瘤大小和生长情况。苏木精-伊红(HE)染色和免疫组织化学技术检测比较两组移植瘤的增殖,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)测定法检测移植瘤的凋亡水平。实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法和western-blot法检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase3的mRNA和蛋白表达水平。结果成功建立了NSCLC A549细胞裸鼠移植瘤模型。沉默A549细胞中TRIM28的表达,可显著抑制A549细胞皮下裸鼠移植瘤的生长,并促进癌细胞的凋亡。此外,TRIM28基因敲除在基因和蛋白水平上降低了Bcl-2的表达,增加了Bax和Caspase3的表达。结论TRIM28siRNA能够明显抑制NSCLC A549裸鼠移植瘤的生长并促进癌细胞的凋亡。

桑树雄花发育过程乙烯合成相关miRNA鉴定与分析

为鉴定桑树雄花发育过程中与乙烯合成相关的新miRNA并探究其功能,本研究利用NCBI上已有的桑树miRNA数据,筛选出与乙烯合成相关的新miRNA,并进行靶基因预测及功能注释。通过生物信息学技术共鉴定到58个新miRNA,对这些新miRNA结构分析发现,首位碱基以U为主,占比为40%;长度以21 nt为居多,占比67%。对新miRNA进行靶基因预测并进行GO与KEGG分析,GO富集分析发现靶基因主要集中在乙烯激活信号通路、乙烯激活信号的负调控和乙烯反应,KEGG通路富集分析发现靶基因主要富集到代谢通路为植物激素信号转导途径和MAPK信号通路。结合降解组测序,本研究对预测到的6个新miRNA的靶基因进行靶位点分析,发现其均可作用在相应靶基因上。采用RT-qPCR技术检测新miRNA在桑树雄花不同发育阶段的表达水平,发现mno-miRn69-5p随着雄花发育表达呈现下降的趋势,而保守mno-miR172表达呈现上升的趋势。mno-miRn204-3p与mno-miRn138-3p的表达在未分化期到雄花分化初期上升,在雄花分化初期到总苞形成期则下降。mno-miRn211-5p与mno-miRn227-5p的表达在未分化期到花序分化期表达水平上升,在花序分化期到总苞形成期则表达水平下降,表明这些新的miRNA在桑树雄花发育过程中发挥着不同的作用。本研究为揭示桑树中miRNA在调控乙烯合成途径提供理论基础。

不同制备条件及贮存温度对四种桑树花粉活力影响

为探究不同处理条件对桑树花粉活力的影响,本研究以‘冀桑2号’、‘华桑’、‘路杨’及‘物45’四个桑树品种为研究对象,采用碘-碘化钾(I2-KI)法测定花粉活力,观察其在不同制备条件(制备温度:19℃、25℃和32℃;制备时间:1 d和7 d)、不同贮存温度(-80℃,-20℃和4℃)下的活力。实验表明,不同的制备条件和贮存温度对四个桑树品种的花粉活力均存在影响,在不同温度制备条件下,‘冀桑2号’与‘路杨’在25℃培养条件下,花粉活力最高,‘华桑’与‘物45’在19℃培养条件下,花粉活力最高;在相同的培养温度下,同一品种培养7 d的活力低于培养1 d的活力,其中19℃培养条件下的‘华桑’花粉活力最高为95.26%。四个桑树品种花粉的生活力在经过贮存一定时间后,与制备后的初始活力相比均存在不同程度的活力的下降;四个桑树品种在不同贮存温度条件下,随着储藏温度越低,花粉保存活力越高,在-80℃储藏60 d后,‘华桑’有活力的花粉最高为87.4%。综上所述,‘华桑’花粉在19℃温度下制作及-80℃保存处理后,花粉活力最高。本研究探索桑花粉的制备与贮存条件,有助于解决因气候、地域不同对杂交带来的影响,为桑树杂交育种以及生产实践以供参考依据。