Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。

适应H9亚型禽流感病毒增殖的MDCK悬浮细胞株的驯化及其生物学特性

本研究通过筛选驯化的MDCK细胞获得无血清悬浮生长MDCK细胞(命名为MDCK-sus),测定该细胞的比生长速率、细胞活力及细胞最大生长密度等生长特性,采用间接免疫荧光法和流式细胞仪检测法比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞流感病毒受体[唾液酸-α-2,3-半乳糖糖链受体(SAα2,3Gal)和唾液酸-α-2,6-半乳糖糖链受体(SAα2,6Gal)]的丰度,用荧光定量PCR检测比较细胞中α-2,3唾液酸转移酶(ST3Gals)基因与α-2,6唾液酸转移酶(ST6Gals)基因表达水平的差异,通过测定流感病毒血凝HA效价比较母本MDCK细胞与MDCK-sus细胞对流感病毒的增殖能力。结果表明,经驯化获得的适合无血清悬浮培养的MDCK-sus细胞,细胞密度最高可达1ml 3.6×106个细胞,最大比生长速率可达1 d 0.56。MDCK-sus细胞表面流感病毒受体SAα2,3Gal的丰度明显高于母体MDCK细胞,ST3Gal转移酶基因表达水平也明显高于母本MDCK细胞。MDCK细胞驯化后增殖禽流感病毒的能力增强,其中H9亚型禽流感病毒AH1102株在MDCK-sus细胞中HA效价达到9lg2(25μl)。MDCK-sus细胞各种生长特性表明,其适于H9亚型禽流感的繁殖,可以为采用悬浮细胞培养禽流感疫苗的大规模工业化生产提供技术支持。

MDCK单细胞悬浮生长的驯化筛选及其在AIV增殖上的初步应用

采用逐步降低培养基中血清含量的方法获得可悬浮生长的MDCK-Sus细胞株,对其生长代谢情况、细胞膜表面病毒受体丰度,以及在生物反应器中悬浮培养该细胞对禽流感H9亚型病毒增殖进行了初步应用研究。结果表明,MDCK-Sus细胞株可完全适应无血清营养条件并呈单细胞悬浮生长状态,细胞生长旺盛,平均比生长速率达到0.556 d-1,最大活细胞密度达到2.42×106cells·m L-1,并可检测出其细胞膜表面具有正常丰度的唾液酸-α-2,3-半乳糖糖链受体。在MOI为0.05,TPCK处理的胰蛋白酶作用浓度为1μg·m L-1的条件下,AIV-H9亚型病毒JS03株可在MDCK-Sus细胞中获得较好的增殖HA效价,达到8log2·25μL-1。

Marc-145细胞无血清培养驯化、代谢分析及PRRSV增殖能力比较

采用逐步降低培养液中血清用量的方法对Marc-145细胞进行无血清培养驯化并考察其生长代谢、增殖PRRSV(猪繁殖及呼吸综合征病毒)的能力。结果表明,通过在细胞对数生长期更换低浓度血清的培养液或传代操作,Marc-145细胞可完全适应含5%新生牛血清的营养条件,经3次传代后,Marc-145细胞可营正常贴壁生长。然而在1%新生牛血清的营养条件下,初次培养于该条件的Marc-145细胞伪足不伸展,贴壁时间明显延长。经过在该1%血清浓度下10次传代后,Marc-145细胞可贴壁生长,维持较高的存活率,但贴壁较松。由此Marc-145细胞进一步驯化适应无血清悬浮培养条件,筛选获得能够在无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞,且生长状态良好。比较在不同血清浓度及不同培养方式下生长的Marc-145细胞增殖PRRSV的能力,无血清条件下悬浮生长的Marc-145细胞对PRRSV的增殖性能没有改变。

生物反应器中PRRSV工业规模增殖工艺的建立

分析比较了3种不同微载体悬浮培养工艺——分批换液式、消化传代放大式、循环灌注培养式对Marc-145细胞微载体培养效能及生理代谢的特点及差异,并实现了从5 L至60 L反应器放大过程的PRRSV实际增殖应用。结果表明,在5 L动物细胞反应器中使用相同的微载体用量6 g/L,分批换液式培养和消化传代放大式培养仅获得27×105~28×105cells/m L的细胞密度,低于循环灌注培养式的培养能力(59.4×105cells/m L)。根据这3种不同培养工艺的特点,设计并实施了可应用于实际生产的工艺流程,即Marc-145种子细胞以循环灌注培养方式在5 L反应器中完成初级培养,经消化传代工艺,将种子细胞放大接种于60 L反应器中进行分批换液式的二级培养,用于PRRSV的大规模增殖,结果显示PRRSV增殖滴度可达到108.3TCID50/m L。该过程成功地模拟了Marc-145细胞在工业级水平上的放大培养操作工艺,其放大倍数达到1∶3的传代系数,具备实际应用价值。

无血清微载体培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒

为了获得用生物反应器无血清培养基微载体悬浮培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的工艺参数,通过驯化Vero细胞适应无血清微载体悬浮培养后,再优化传染性法氏囊病毒在此细胞上的增殖工艺参数,包括初始细胞密度、微载体浓度、IBDV的感染复数(MOI)、接种时间和病毒收获时间。结果表明:获得适应无血清培养的细胞株——V0株,建立细胞库。获得3 L反应器中培养V0细胞增殖IBDV工艺参数,其初始接种密度为3×105cell/m L、微载体浓度为3 g/L、细胞培养1 d后按MOI为0.2接种IBDV,接毒后120 h收获病毒,可达最高病毒效价109.307TCID50/m L。本研究获得的Vero细胞、IBDV以及各项工艺参数为后续大规模悬浮培养制备法氏囊疫苗提供了生物材料和技术支持。

Marc-145细胞无血清培养液组分的优化筛选

目的:对Marc-145细胞无血清培养液组分及浓度进行优化筛选。方法:采用Plackett-Burman设计和中心组合旋转设计对不同的营养成分进行优化筛选。结果:经Plackett-Burman设计,利用20组实验对14种不同营养成分进行考察,发现孕酮、抗氧化试剂、乙醇胺、维生素B6、维生素B12和脂肪酸复合剂对Marc-145细胞无血清悬浮生长的比生长速率有显著影响;针对该6种因素进行中心组合旋转实验设计,利用53组实验筛选出它们的最优使用浓度分别为孕酮5.5 mg/L、抗氧化试剂250μL/L、乙醇胺2.1 mL/L、维生素B122.86 mg/L、维生素B644μg/L和脂肪酸复合剂215μL/L。结论:经2种实验设计方法优化,确定了Marc-145细胞无血清培养液组分及最适浓度,为无血清悬浮培养Marc-145细胞及增殖猪繁殖及呼吸综合征病毒提供了实验基础。

稳定表达人TMPRSS2蛋白质悬浮生长MDCK细胞系的构建

为了构建能稳定表达人Ⅱ型跨膜型丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)的重组MDCK细胞,并考察该重组细胞株对禽流感H9亚型病毒的增殖能力,采用基因工程的方法,将TMPRSS2基因克隆入真核表达载体中获得重组表达载体p IRES-TMPRSS2。采用25 000线性PEI进行悬浮生长MDCK细胞的转染操作,经两轮G418抗性筛选获得能够稳定表达该蛋白质的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞。RT-PCR、Western blot以及间接免疫荧光检测(IFA)的结果显示,TMPRSS2已在该重组细胞株中正常表达。该重组细胞的悬浮比生长速率达到0.438 d-1;在3 L反应器中,最大细胞密度可达到1 ml6.83×106个。在对6株禽流感H9亚型病毒的连续盲传试验中,经MDCK-Sus-TMPRSS2细胞盲传的子代病毒可以获得较高的血凝效价和半数组织感染滴度。

一种低轨卫星边缘计算场景下联合资源分配的计算卸载策略

卫星边缘计算突破地理限制,实现全球无缝覆盖,赋予偏远地区服务计算能力,针对低轨道(Low Earth Orbit,LEO)卫星边缘计算场景计算能力和通信时间有限的特性,在单LEO卫星边缘节点多地面用户的系统模型下,提出一种基于博弈论计算卸载联合资源分配(Game Theory with Computing Offloading and Resource Allocation,GT⁃CORA)的策略。由于该问题表示为一个混合整数非线性规划问题,将该问题拆解为资源分配和计算卸载两个子问题,通过二分法和拉格朗日乘数法实现最优资源分配,通过博弈论和势博弈证明了纳什均衡的存在性并解决计算卸载问题。仿真结果表明了该策略的有效性,该策略相较全部本地卸载、全部卫星卸载以及贪婪卸载策略,在保持较高的任务成功率下,平均计算开销明显降低,可以满足地面用户任务需求。

DF-1细胞染色体制备及核型分析

按常规方法略加修改制备了DF-1细胞不同代次的染色体标本,并对DF-1细胞基础细胞库（14代）、最高限制代次（50代）细胞及高于最高代次10代（60代）细胞的染色体核型进行了比较分析.结果表明,DF-1细胞染色体数目2n=68～74;同时对各代次主要的前10对大染色体进行着丝粒定位发现1号和9号为中部着丝点染色体,2号、4号和7号为亚中部着丝点染色体,3号、6号、8号和10号为近端部着丝点染色体,5号为性染色体.在基础细胞库中存在的染色体标志,在最高代次细胞中也存在,并且核型相同.

电气设备检修中的问题及对策分析

近几年,随着经济的发展,我国电气设备检修技术越来越先进。在电力系统当中,电气系统设备是十分关键的一个组成部分,从电网安全平稳运行的角度上来看,进行电力系统电气设备的检修是非常重要的。能否高质量供电不仅与我国的政治经济发展息息相关,同时更对人们的正常生活有很大影响。因此,对电力设备进行经常性检修维护就显得尤为重要。无论是对于发电、输电还是配电系统中的电气设备的检修,程序都必须极为严格。否则,一旦发生事故就会对于电力系统安全稳定运行造成非常严重的影响。从目前的情况来看,变电所电气设备检修运行工作中常常存在着一些问题,本文将对这些问题进行分析,同时提出一些相应的解决措施。希望通过本文,能够为电气设备检修运行工作提供一些参考和帮助。

DF-DF-1细胞的保存期试验及致瘤性鉴定

为研究DF-1细胞的保存期及其传代过程中的稳定性和安全性,将来源于ATCC的DF-1细胞建立细胞库,取液氮保存12、24及48个月的DF-1细胞复苏,经3次传代后,观察不同批次细胞的生长特性并接种鸡传染性法氏囊病病毒,研究各批次细胞出现病变的时间及病毒含量;同时制备不同代次细胞的染色体并进行核型分析;对基础细胞库14代和最高代次60代的DF-1细胞进行致瘤性检测。结果显示,DF-1细胞在液氮中保存48个月,对细胞生长特征及增殖病毒无明显影响,经传60代后的细胞,染色体核型无明显差异且无致瘤性,表明DF-1细胞在传代过程中是稳定且安全的。

响应面法优化大肠埃希菌生产PCV2 Cap蛋白的诱导条件

为提高重组大肠埃希菌发酵生产PCV2Cap蛋白的产量,优化宿主菌的表达条件。在单因素试验基础上,以接种量、诱导时间和诱导温度为自变量,目的蛋白产量为响应值,根据响应面法的Box-Behnken中心组合设计原理,研究各自变量及其交互作用对PCV2Cap蛋白产量的影响,利用Design-Expert软件和响应面分析相结合的方法对诱导条件进行优化。结果表明:发酵的最佳诱导条件为接种量φ=2.21%,诱导时间21.76h,诱导温度18.2℃。在该诱导条件下,摇瓶中获得最高蛋白产量为318.50mg/L,发酵罐获得最高蛋白产量为1 200.00mg/L。采用响应面分析方法能够有效地提高目的蛋白的表达量。

高压电气设备检修试验中的问题及对策

近几年,随着科技水平的不断提高,高压电气设备的应用越来越多。社会上各行各业都离不开电气设备的使用,因此电气设备的安全性成为使用过程中的重点关注内容。对电气设备的安全性而言,进行电力试验预防手段的研究十分必要。因此,通过目前电气设备预防现状入手,探讨电气设备在电力试验中的具体预防手段。

坚守,为了更好的团圆——战“疫”之下的邮储逆行者

面对新冠肺炎疫情,全国人民抗疫的信念坚定如磐.在这场没有硝烟的战争中,万千邮储人坚守岗位,用各种方式贡献着自己的抗疫力量,平凡中见伟大,坚守中显初心.他们,是战“疫”之下的邮储逆行者!返岗!哪怕前方是冰雪泥沼疫情发生后,湖北省公共交通停运.邮储银行湖北省鄂州市分行行长叶兵心系客户与员工,第一时间往单位返回,返岗途中自驾车深陷淤泥,在乡间小路步行4个小时,终于返回工作岗位.

NDV、IBDV二联灭活苗对蛋雏鸡免疫程序研究

为探讨鸡新城疫病毒（NDV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）二联灭活疫苗在蛋雏鸡养殖中的实际应用效果进行本试验.用鸡新城疫、传染性法氏囊二联灭活疫苗及传染性法氏囊活疫苗以不同免疫程序免疫7 ～ 14日龄蛋雏鸡,定期监测NDV、IBDV抗体水平,并在雏鸡60日龄时进行攻毒保护试验.结果表明,各二联苗免疫组NDV抗体水平在免疫后14 d即达到NDV血清学最低有效保护价标准,并维持至雏鸡60日龄.免疫后28 d,灭活苗一次性免疫各组IBDV中和抗体水平显著高于活苗两次免疫组,琼扩抗体水平与活苗两次免疫组无明显差异.雏鸡60日龄时攻毒,各免疫组均100％保护,对照组无保护.以上结果说明该二联灭活疫苗可替代IBDV活毒疫苗用于7～14日龄商品雏鸡免疫,免疫期至少为60d.