血必净通过Rho激酶信号通路对脓毒症急性肾损伤后肾小管细胞的影响研究

目的探讨早期应用血必净通过Rho激酶信号通路对脓毒症急性肾损伤后肾小管细胞凋亡的保护作用。方法 2014年8月—2015年6月,54只雄性SD大鼠采用随机数字表法分为假手术组、脓毒症组、血必净组,每组18只。脓毒症组和血必净组以盲肠结扎穿孔(CLP)法制造脓毒症模型,脓毒症组大鼠CLP后0.5 h尾静脉注射0.9%氯化钠溶液4 ml/kg;血必净组大鼠CLP后0.5 h尾静脉注射血必净注射液4 ml/kg。造模后6、24 h每组分别选取9只大鼠采用激光多普勒血流仪测定血流灌注(BPU)情况,采用全自动生化仪检测血肌酐、尿素氮、肌酐清除率(Cr Cl),病理组织学检测评定肾小管损伤评分,采用原位末端标记(TUNEL)法计算凋亡指数(AI),Western blotting法检测Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK-1)、肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT-1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)的表达水平。结果 3组大鼠造模后6 h BPU及造模后24 h BPU、血肌酐、尿素氮、Cr Cl比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中造模后6 h,脓毒症组大鼠BPU较假手术组升高,血必净组大鼠BPU较假手术组升高、较脓毒症组降低(P<0.05);造模后24 h,脓毒症组大鼠BPU较假手术组降低,脓毒症组大鼠血肌酐、尿素氮、Cr Cl较假手术组升高,血必净组大鼠尿素氮、Cr Cl较假手术组升高,血必净组大鼠BPU较脓毒症组升高,血必净组大鼠血肌酐、尿素氮、Cr Cl较脓毒症组降低(P<0.05)。造模后6 h,3组肾小管损伤评分、AI比较,差异无统计学意义(P>0.05);造模后24 h,3组肾小管损伤评分、AI比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中脓毒症组肾小管损伤评分、AI较假手术组升高,血必净组肾小管损伤评分、AI较假手术组升高,血必净组肾小管损伤评分、AI较脓毒症组降低(P<0.05)。造模后6、24 h,3组ROCK-1、MYPT-1和Caspase-3表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中造模后6 h,脓毒症组和血必净组ROCK-1、MYPT-1和Caspase-3表达水平较假手术组升高(P<0.05);造模后24 h,脓毒症组ROCK-1、MYPT-1和Caspase-3表达水平较假手术组升高,血必净组ROCK-1、MYPT-1表达水平较假手术组升高,血必净组ROCK-1、MYPT-1和Caspase-3表达水平较脓毒症组降低(P<0.05)。结论早期应用血必净可以通过Rho激酶信号通路减少肾小管细胞在脓毒症进程中的凋亡,改善病理学改变,减轻脓毒症导致的急性肾损伤。

血必净联合法舒地尔对脓毒症急性肾损伤后肾小管细胞凋亡的影响

目的探讨早期应用血必净联合法舒地尔对脓毒症急性肾损伤后肾小管细胞凋亡的影响及机制。方法将60只雄性SD大鼠随机分为分假手术组、脓毒症组、血必净组、法舒地尔组和联合用药组,每组12只。以盲肠结扎穿孔法制造脓毒症模型,假手术组麻醉后开腹翻动肠道,随即关腹;脓毒症组按4ml/kg尾静脉注射0.9%氯化钠注射液;血必净组按4ml/kg注射血必净;法舒地尔组按20mg/kg注射盐酸法舒地尔;联合用药组予等剂量血必净和法舒地尔注射。在造模后6、24h再将每组随机分为2个亚组,每个亚组6只。检测各时间点大鼠的肾功能和炎症指标,观察肾小管病理改变、测定肾小管损伤评分,采用TUNEL法观察肾小管凋亡细胞,并计算凋亡指数(AI)。用免疫印迹法测定ROCK-1、MYPT-1和caspase-3表达的变化。结果(1)造模后24h时与脓毒症组相比,各用药组肾功能均能明显改善(P<0.05),在抑制TNF-α、IL-6表达上联合用药组优于两单药组(均P<0.05)。(2)造模后24h时联合用药组与两单药组比较,肾小管损伤评分和AI值明显降低(均P<0.05)。(3)造模后24h时联合用药组与两单药组比较,更能抑制MYPT-1的磷酸化,促使caspase-3表达下降(均P<0.05)。结论脓毒症早期血必净联合法舒地尔可以通过Rho/ROCK信号通路抑制凋亡蛋白的表达,减少肾小管细胞在脓毒症进程中的凋亡,发挥协同作用减轻脓毒症导致的急性肾损伤。

高迁移率族蛋白B1对呼吸机相关性肺炎患者短期内撤机的预测价值

目的探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对呼吸机相关性肺炎(VAP)患者短期内撤机的预测价值。方法选取绍兴市人民医院2016年1月至2018年12月行机械通气且发生VAP的62例患者为研究对象,根据临床VAP的发生时间分成VAP早发组32例和晚发组30例。比较两组患者机械通气时间、ICU住院时间及确诊VAP当天急性生理和慢性健康评分Ⅱ(APACHEⅡ)、临床肺部感染评分(CPIS)、氧合指数(PaO2/FiO2),支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子(TNF-α、IL-8、HMGB1)水平,肺泡巨噬细胞吞噬活性及HMGB1蛋白相对表达量,同时评估上述指标对7 d机械通气撤机拔管的预测效能。结果VAP晚发组机械通气时间、ICU住院时间明显短于早发组(均P<0.05),确诊VAP当天APACHEⅡ、CPIS、PaO2/FiO2两组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。早发组确诊VAP时BALF中TNF-α、IL-8、HMGB1水平明显高于晚发组(均P<0.05)。晚发组肺泡巨噬细胞吞噬活性强于早发组,巨噬细胞中HMGB1蛋白相对表达量低于早发组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。62例患者7 d机械通气撤机拔管率为71.0%。BALF中HMGB1水平预测7 d机械通气撤机拔管的AUC、截断值、灵敏度、特异度为0.75、50.0μg/L、0.78、0.70,肺泡巨噬细胞吞噬活性预测7 d机械通气撤机拔管的AUC、截断值、灵敏度、特异度为0.79、6.5、0.73、0.70,巨噬细胞HMGB1蛋白相对表达量预测7 d机械通气撤机拔管的AUC、截断值、灵敏度、特异度为0.73、1.4、0.72、0.73。结论HMGB1和肺泡巨噬细胞吞噬活性可作为预测VAP患者短期内撤机的可靠指标。

糖调节异常合并非酒精性脂肪性肝病患者血内皮素-1与胰岛素抵抗的相关性研究

目的探讨糖调节异常合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者的血内皮素-1(ET-1)与胰岛素抵抗(IR)的相关性。方法将92例患者根据是否合并NAFLD分为单纯糖调节异常组(A组)58例和糖调节异常合并NAFLD组(B组)34例,分别测定两组患者身高、体重、收缩压(SBP)、舒张压(DBP),抽空腹血检查ET-1、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、餐后2h血糖(PBG)、糖化血红蛋白(Hb A1C)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、谷氨酰转肽酶(GGT)。并计算BMI、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素作用指数(IAI)及定量胰岛素敏感性指数(QUICKI)。对两组上述检测指标进行比较并作相关性分析。结果 B组的体重、BMI、FINS、HOMA-IR、ET-1、SBP、DBP、ALT、AST、TG、HDL-C均明显高于A组(均P<0.05),IAI、QUICKI明显低于A组(P<0.05)。两组间Hb A1C、FPG、PBG、TC、LDL-C、GGT差异均无统计学意义(均P>0.05)。Pearson相关分析结果显示,ET-1与体重、BMI、FINS、HOMA-IR呈正相关(P<0.01),与IAI、QUICKI呈负相关(P<0.01)。结论糖调节异常合并NAFLD患者血ET-1水平升高,IR程度明显加重。因此,糖调节异常合并NAFLD患者更需及早进行内皮功能障碍与IR干预,防治糖尿病和心脑血管终点事件的发生。

高迁移率族蛋白B1和肺泡巨噬细胞活性对呼吸机相关性肺炎患者短期内撤机拔管的影响

目的探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)与巨噬细胞的吞噬活性对呼吸机相关性肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)患者预后的评估价值。方法前瞻性选取2016年1月至2018年12月绍兴市人民医院和绍兴市立医院重症医学科诊断为VAP患者62例。收集患者基本资料,根据临床VAP的发生时间分成VAP早发组和VAP晚发组。在确诊VAP后24 h内进行急性生理和慢性健康评分Ⅱ(APACHEⅡ)评分,临床肺部感染评分(CPIS),计算氧合指数(PaO2/FiO2)。并对患者进行支气管肺泡灌洗,检测灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、HMGB1的浓度,提取肺泡巨噬细胞进行培养,检测巨噬细胞内HMGB1的相对蛋白含量和吞噬活性。对两组患者相关指标的差异进行比较,采用受试者工作特征(ROC)曲线评价相关指标对患者预后的判断价值,Kaplan-Meier法绘制患者的7 d撤机拔管率,多因素Logistic回归分析影响患者预后的相关因素。结果纳入的62例VAP患者中,VAP早发组30例,VAP晚发组32例,两组患者基线资料差异无统计学意义(均P>0.05)。VAP早发组和VAP晚发组确诊后24 h内的APACHEⅡ评分、CPIS评分、氧合指数以及机械通气时间、ICU住院时间均差异无统计学意义(均P>0.05)。但VAP早发组患者BALF中TNF-α、IL-8、HMGB1浓度[(18.8±4.1)μg/L、(55.8±18.6)μg/L及(299±109)μg/L]较VAP晚发组[(15.1±4.0)μg/L、(4.4±1.2)μg/L及(40.4±14.9)μg/L]显著增高(均P<0.05)。VAP早发组的巨噬细胞HMGB1蛋白相对含量高于晚发组(1.9±0.8 vs 1.2±0.6),而巨噬细胞的吞噬活力显著低于VAP晚发组[(4.8±2.7)个微球/细胞vs(6.6±2.0)个微球/细胞](均P<0.05)。BALF中HMGB1、巨噬细胞HMGB1相对蛋白含量、吞噬功能预测患者7 d脱机拔管的ROC曲线下面积分别为0.75(95%CI:0.65~0.79,P=0.04)、0.73(95%CI:0.61~0.86,P=0.04)、0.79(95%CI:0.68~0.90,P<0.01)。以HMGB1水平50.0μg/L为最佳截断值,低HMGB1患者7d撤机拔管率明显优于高HMGB1患者(84.3%vs 66.7%,χ^2=14.3,P<0.01)。多因素Logistic回归分析显示BALF中的HMGB1浓度(OR=1.033,95%CI:0.989~1.080,P=0.044)、肺泡巨噬细胞内HMGB1的蛋白含量(OR=1.433,95%CI:1.015~1.613,P=0.007)及吞噬能力(OR=2.099,95%CI:1.280~3.442,P=0.003)均是VAP患者7 d内撤机拔管的独立危险因素。结论HMGB1和肺泡巨噬细胞的活力可以作为VAP患者预后的可靠指标。

高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4信号通路在脓毒症大鼠致急性肺损伤中的作用研究

目的探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)信号通路对脓毒症导致的急性肺损伤大鼠的影响。方法将60只清洁级雄性Sprague Dawley大鼠分为假手术组、脓毒症组和实验组,每组各20只。假手术组大鼠麻醉后开腹翻动肠道,随即关腹;脓毒症组和实验组行盲肠结扎穿孔(CLP)术后0.5 h于尾静脉分别注射等渗Na Cl溶液(4 m L/kg)及抗HMGB1单克隆抗体(2 mg/kg)。各组分别取10只用于观察大鼠CLP建模后7 d存活情况,其余大鼠于造模后24 h处死并留取肺组织标本。计算各组大鼠的肺损伤Smith评分,并比较各组大鼠HMGB1和TLR4阳性蛋白在肺组织中的表达水平。采用酶联免疫吸附测定检测各组大鼠肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、HMGB1和TLR4水平,计算每个巨噬细胞内微球蛋白数以比较各组大鼠肺泡巨噬细胞(AM)的吞噬功能,并采用Western-blotting法测定AM内HMGB1、TLR4蛋白表达水平。结果假手术组大鼠建模后7 d全部存活,脓毒症组大鼠仅3只存活,实验组大鼠5只存活。各组大鼠间存活情况的比较,差异有统计学意义(χ~2=10.833,P=0.004);且假手术组大鼠的存活情况明显优于脓毒症组与实验组大鼠(P均<0.017),而脓毒症组与实验组大鼠间存活情况比较,差异无统计学意义(P=0.120)。假手术组、脓毒症组及实验组大鼠间肺组织损伤评分[(2.20±0.27)、(8.20±1.27)、(4.25±2.21)分,F=56.432,P<0.001],肺组织HMGB1阳性蛋白[(10.4±1.5)、(34.4±5.0)、(26.6±6.9),F=35.203,P=0.003]、TLR4阳性蛋白[(10.6±2.1)、(48.0±5.8)、(38.2±5.3),F=103.414,P=0.002],BALF中TNF-α[(19±4)、(45±4)、(35±4)μg/L,F=2.749,P<0.001]、IL-6[(56±19)、(86±15)、(70±19)μg/L,F=4.648,P=0.001]、HMGB1[(41±18)、(70±15)、(56±12)μg/L,F=7.254,P=0.002]、TLR4[(20.9±1.8)、(51.2±1.6)、(49.8±2.6)μg/L,F=3.978,P=0.035],AM的吞噬功能[(21.8±2.7)、(3.1±1.9)、(12.6±2.2)个,F=32.821,P=0.001]及AM中HMGB1蛋白[(11±3)、(40±15)、(24±13),F=7.253,P<0.001]、TLR4蛋白[(0.9±0.4)、(1.2±0.6)、(1.1±0.4),F=3.984,P=0.028]的比较,差异均有统计学意义。进一步两两比较发现,脓毒症组与实验组大鼠肺组织损伤评分,肺组织HMGB1阳性蛋白、TLR阳性蛋白表达水平,BALF中TNF-α、IL-6、HMGB1水平及AM中HMGB1蛋白表达水平均明显高于假手术组大鼠,且脓毒症组大鼠更高(P均<0.05);脓毒症组及实验组大鼠AM的吞噬功能均显著低于假手术组,且脓毒症组更低(P均<0.05);脓毒症组及实验组大鼠BALF中TLR4水平及AM中TLR4蛋白表达水平均显著高于假手术组(P均<0.05),但脓毒症组与实验组间上述指标的比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论通过抑制HMGB1/TLR4信号通路可以缓解脓毒症致肺损伤大鼠肺组织的炎症损伤,抑制炎症介质过度释放,并增强AM的细胞吞噬功能。

血必净对脓毒性急性肾损伤大鼠肾小管细胞凋亡和相关蛋白表达的影响

目的探讨早期应用血必净对脓毒性急性肾损伤大鼠肾小管细胞凋亡,及相关蛋白B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响。方法 54只雄性大鼠分为假手术组(Sham组)、脓毒症组(CLP组)、血必净组(CLP+XBJ组)三组,每组18只;以术后12、24和48 h作为时间观察点,将各组再分为3个亚组,每组6只。在各时间点检测大鼠的肌酐清除率(CrCl)、肾脏血流灌注量,并留取肾脏组织观察病理学变化,计算肾小管损伤评分,采用原位末端标记(TUNEL)法并通过计算积分光密度值(IOD)测定肾小管凋亡细胞,采用Western-blotting法测定肾脏髓质Bcl-2、Bax的变化。结果三组大鼠的CrCl和肾脏血流灌注量在术后各时间点差异均有统计学意义(F=6.405、18.821,P<0.05);且CLP+XBJ组在术后48 h时CrCl和肾脏血流灌注量明显高于CLP组[(2.1±0.5)ml/min/100 g vs.(1.1±0.3)ml/min/100 g,(159±38)BPU vs.(79±32)BPU;P均<0.05]。三组大鼠肾小管损伤评分比较,不同时间点差异存在统计学意义(F=5.461,P<0.05);且CLP+XBJ组与CLP组比较,24、48 h时评分均有显著下降[(1.6±0.5)vs.(2.8±0.8),(1.8±0.8)vs.(3.6±0.6);P均<0.05]。三组大鼠各时间点凋亡细胞IOD值,差异存在统计学意义(F=7.259,P<0.05);CLP+XBJ组各时间点的IOD值均明显小于CLP组[(26.6±6.9)vs.(34.4±5.0),(38.2±5.3)vs.(48.0±5.8),(37.6±2.2)vs.(53.8±6.7);P均<0.05]。同时,CLP+XBJ组能升高大鼠肾脏髓质Bcl-2的表达,抑制Bax的表达,维持Bcl-2/Bax的平衡,24、48 h时其Bcl-2[(1.30±0.09)vs.(0.76±0.09),(2.12±0.38)vs.(0.51±0.07);P均<0.05]和Bax[(1.19±0.37)vs.(1.95±0.90),(1.48±0.15)vs.(2.69±0.39);P均<0.05]的表达水平与脓毒症组相比差异均有统计学意义。结论早期应用血必净可以减少肾小管细胞在脓毒症进程中的凋亡,改善脓毒性急性肾损伤大鼠肾脏的病理学改变,维持Bcl-2/Bax的平衡,减轻脓毒症导致的肾功能损害。

血必净对脓毒症大鼠肾脏细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

目的探讨早期应用血必净对脓毒症导致急性肾损伤后肾小管细胞凋亡的影响,及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的变化。方法 54只SD大鼠,♂,随机分为假手术组、脓毒症组、血必净组,每组18只;各组再分为3个亚组,每组6只。根据实验要求分别以术后12,24,48 h作为时间观察点,在各时间点检测大鼠的血液生化指标,测定肾脏血流、并留取肾脏组织观察病理学变化,测定肾小管损伤评分,采用原位末端标记法测定肾小管凋亡细胞,并计算积分光密度值(IOD)。采用免疫印迹法测定Bcl-2、Bax的变化。结果血必净组能明显改善肾功能,稳定血流动力学,减轻组织病理学变化,减少肾小管细胞凋亡,肾小管损伤评分和IOD值与脓毒症组相比有显著差异(P<0.01)。同时,血必净组能升高Bcl-2的表达,抑制Bax的表达,保持Bcl-2/Bax的平衡,与脓毒症组相比有显著差异(P<0.01)。结论早期应用血必净可以减少肾小管细胞在脓毒症进程中的凋亡,改善脓毒症导致急性肾损伤的病理学改变,保持Bcl-2/Bax的平衡,减轻脓毒症导致的肾损伤。

糖尿病并发败血症病原菌分布及耐药性

目的分析糖尿病合并败血症患者的病原菌种类及其对抗菌药物的耐药性,为合理选用抗菌药物提供依据。方法对2011年1月至2014年7月在浙江大学医学院附属第二医院确诊的80例糖尿病合并败血症患者的临床资料、血培养和药敏结果进行回顾性分析。结果 80例糖尿病合并败血症患者中原发感染部位以泌尿道感染最多,其次为呼吸道感染。检出病原菌中革兰阴性菌44株,占55.0%,其中大肠埃希菌38株,肺炎克雷伯菌6株;革兰阳性菌36株,占45.0%,其中葡萄球菌属24株,链球菌属12株。药敏试验中大肠埃希菌对环丙沙星、左氧氟沙星、氨苄西林和哌拉西林耐药率达50.0%以上;肺炎克雷伯菌对氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林、头孢西丁、头孢唑林、头孢呋辛和妥布霉素100.0%耐药;葡萄球菌属对苯唑西林、克林霉素和青霉素G耐药率高达75.0%以上。结论糖尿病并发败血症患者以革兰阴性杆菌感染为主,但革兰阳性菌感染率与以往报道比有上升趋势,可选用碳青霉烯类抗菌药物以及头孢含β-内酰胺酶抑制剂的复合药作为经验性治疗,考虑阳性菌感染时首选万古霉素,同时要尽早行血培养,及时更换为敏感抗生素,减少耐药菌株的出现,降低糖尿病合并败血症的病死率。

槲皮素对肾细胞氧化损伤的保护作用及机制

目的研究槲皮素对肾细胞氧化损伤的保护作用及机制。方法采用肾细胞模型HK-2,用过氧化氢诱导肾细胞的氧化损伤,在采用CCK8方法观察槲皮素对HK-2细胞活力影响的基础上,采用免疫印迹方法观察槲皮素处理后的细胞内信号通过改变,检测细胞内还原性物质谷胱甘肽（GSH）含量的改变。结果发现过氧化氢可诱导HK-2的氧化损伤,细胞活力分别下降至对照组的34.9%,而槲皮素预处理组（10~40μM）,细胞活力在40%~70%之间,提示其有保护细胞损伤作用。槲皮素可减少HK2细胞内由过氧化氢刺激造成的活性氧（ROS）含量上升（153%）,使其下降至130%~110%。此外,槲皮素可增加细胞内抗氧化酶GPX1及SOD2及GSH的含量,促进p-AMPK及LC3的降解,降低p-m TOR,抑制BAX和Caspase3的活化。结论槲皮素对肾细胞的氧化损伤有保护作用,其机制可能与抗氧化作用及促进自噬的途径有关。