细胞毒性T淋巴细胞来源外泌体抑制肝星状细胞活化的机制

目的探讨细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来源外泌体能否下调HBx表达从而抑制肝星状细胞(HSC)活化。方法收集HepG2、HepGA14、CTL细胞上清液提取外泌体(分别简写为NC-exo、HBV-exo、CTL-exo),透射电镜观察其形态,Western Blot检测外泌体标志物CD63和TSG101的表达。将氟硼二吡咯染料(BODIPY)标记的NC-exo、HBV-exo以及CTL-exo与HBV-exo按不同比例混合后,分别与HSC LX-2(HSC-LX2)共培养,荧光显微镜观察外泌体能否进入LX-2细胞,倒置显微镜观察细胞形态学改变,实时荧光定量PCR(qPCR)检测LX-2细胞中TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen1)等活化生物标志物的表达。将CTL-exo加入到HepGA14培养体系中,qPCR检测HepGA14细胞内HBV DNA、cccDNA及外泌体中HBx mRNA表达水平,Western Blot检测外泌体HBx蛋白表达水平。符合正态分布的计量资料两组间比较采用成组t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果外泌体均为双层膜结构的微囊,呈圆形或椭圆形,囊泡的直径为50~100 nm,表达标志性蛋白CD63和TSG101。荧光显微镜观察示外泌体可进入LX-2细胞,并且HBV-exo进入LX-2细胞后,HSC胞体增大、胞突伸展。qPCR结果示NC-exo、HBV-exo、NC-exo+HBV-exo和Con组LX-2细胞中TGF-β1、α-SMA、Collagen1基因表达水平差异均有统计学意义(F值分别为444.678、417.144、571.508,P值均<0.05)。CTLexo干预HepGA14细胞后,qPCR结果显示HepGA14细胞中HBV DNA、cccDNA表达水平较对照组明显下降(P值均<0.05),外泌体中HBx mRNA相对表达量明显下降(P<0.05);HBx蛋白表达水平与对照组相比也明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。CTL-exo和HBV-exo按照不同比例(2∶1、5∶1、10∶1)进行混合后干预LX-2细胞,qPCR结果显示各组间LX-2细胞中TGF-β1、α-SMA和Collagen1基因表达随着CTL-exo比例的增加而逐渐减弱,差异有统计学意义(P值均<0.05)。结论CTL-exo可下调HBV-exo中HBx蛋白表达抑制HSC活化,提示CTL-exo有抗乙型肝炎肝纤维化作用。