2016年-2017年四川省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

为了解近年来四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异和分子流行病学情况,通过RT-PCR方法,对四川省各地疑似病料进行PRRSV检测,确定获得阳性样本基因型和对GP5基因遗传进化进行分析。结果显示,149份疑似病料中经ORF7片段检测33份为阳性,阳性率为22.15%(95%CI:15.8%~29.7%);通过对NSP2片段的检测,其中有9份为PRRSV高致病性毒株(HP-PRRSV),5份为PRRSV经典毒株,8份为PRRSV NADC-30样毒株;通过对GP5基因进行扩增和序列测定,得到11株部分的GP5基因序列数据,所获序列与已报道对应核苷酸序列同源性为60.4%~99.8%,推导的氨基酸序列的同源性为74.3%~100%。结果表明,近两年四川地区PRRSV主要流行毒株为HP-PRRSV,同时新的变异毒株NADC30的流行呈上升趋势。四川地区乃至国内各地区的PRRSV基因在逐渐变异,且毒株的流行趋势在转变,提示应加强对PRRSV流行及变异的监测。

牦牛肠道病毒间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

为了建立准确、快速的牦牛肠道病毒(yak enterovirus)检测方法,利用本实验室已获得的一株牦牛肠道病毒SWUN-AB001,免疫健康兔获得抗SWUN-AB001高免血清,建立了一种检测牦牛肠道病毒的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并对其工作条件和时间进行筛选,优化出最佳条件。采用该方法对40份临床腹泻样本进行了牦牛肠道病毒的检测,并与RT-PCR的检测结果进行比较。结果表明:获得的高免血清在该IFA方法中的最佳稀释度为1∶100,工作时间为30min;FITC标记的羊抗兔IgG(二抗)的稀释度为1∶800,工作时间为45min,牦牛肠道病毒特异性亮绿色荧光颗粒清晰可见;同时与牛病毒性腹泻病毒、轮状病毒、大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌和空肠弯曲杆菌反应均未见明显的荧光颗粒;该方法能够检测SWUN-AB001病毒的最低浓度约为20TCID50·mL-1;该方法的临床检测结果与RT-PCR的检测结果之间无差异(P=0.329)。结果表明该方法特异性强、重复性好、灵敏度高,为该病毒在牦牛养殖地区的流行病学调查、临床诊断和快速诊断试剂的开发奠定了基础。

川藏地区牦牛牛病毒性腹泻病毒分子流行病学调查及分离鉴定

为了解川藏高原地区牦牛牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的感染情况和牦牛BVDV的主要流行亚型及遗传变异情况,采用RT-PCR方法,对四川和西藏部分高原地区采集的149份临床腹泻牦牛粪便开展分子流行病学调查,根据5′-UTR、Npro和E2基因的变异研究该地区牦牛BVDV的遗传变异情况。同时,通过RT-PCR、病毒分离培养和间接免疫荧光检测等方法鉴定牦牛BVDV分离株。结果表明,149份粪便中,BVDV阳性检出率为19.46%[95%置信区间(CI)=13.4%~26.7%],其中西藏地区牦牛BVDV阳性检出率为27.14%(95%CI=17.2%~39.1%),四川地区牦牛BVDV阳性检出率为12.66%(95%CI=6.2%~22.0%)。随机抽取10份阳性样本测序,根据5′-UTR、Npro和E2基因序列建立系统发育进化树分析,10份样本为BVDV-1型,包括BVDV-1a(n=4)和1d(n=6)亚型。此外,成功分离鉴定出两株致细胞病变型(cytopathic,cp)BVDV,分别属于牦牛BVDV-1a和1d亚型,命名为SWU-Z10和SWU-L8。研究结果提示,川藏部分高原地区牦牛存在BVDV感染,BVDV-1a和1d为牦牛感染的主要亚型。本研究丰富了BVDV的分子流行病学资料,也为后续研制牦牛专用BVDV疫苗提供理论基础。

不同来源的3株牛病毒性腹泻病毒对小鼠的致病性分析

为分析牛病毒性腹泻病毒(BVDV)对小鼠的致病性,选取BALB/c小鼠为试验动物,攻毒组通过腹腔注射接种不同来源的3株牦牛源BVDV1-DJ2、BVDV1-Z6和OregonC24V毒株,对照组接种DMEM培养基。分别于接种后第5、7、10天收集小鼠血液和组织,并通过血常规、病理组织学、荧光定量PCR等方法对病毒感染小鼠的致病性进行研究。结果显示:攻毒后,Z6组小鼠表现的临床症状较DJ2组严重;攻毒组淋巴细胞、白细胞、血小板含量显著降低;荧光定量PCR结果显示,BVDV在肺和肝中的检出率Z6组明显高于DJ2组;HE染色可见攻毒组肝静脉内出现炎性细胞浸润、肠绒毛上皮细胞坏死和脱落,还可见脾内吞噬细胞增多和脾小结反应性增生、肺泡萎缩和出血等病理变化,与OregonC24V组相比,Z6组病变最严重,DJ2组较轻。以BALB/c小鼠为试验动物,通过腹腔注射的方式可以为BVDV感染小鼠的致病性及模型的构建提供数据支持和指导。

四川地区猪细环病毒1型的流行病学调查和分子特征研究

为了解猪细环病毒1型(TTSuV1)在四川地区猪群中的流行情况及其遗传进化关系,采用PCR对四川省不同地区的5个规模化猪场采集的140份临床健康猪血清进行检测,并根据NCBI已发表的TTSuV1的全基因组序列,对TTSuV1中的2个亚型TTSuV1a和TTSuV1b进行全基因的扩增。结果显示,在140份临床健康猪血清样本中TTSuV1a和TTSuV1b的阳性检出率分别为49.29%(95%CI:40.7%~57.9%)和39.29%(95%CI:31.1%~47.9%)。通过克隆转化,序列测定后拼接获得TTSuV1a的近似全基因组长为2 497bp,TTSuV1b为2 693bp,对测得序列进行同源性和遗传进化分析。结果表明,扩增得到TTSuV1a的ORF1和ORF2序列,与国内外已发表的参考毒株间的核苷酸同源性分别为79.3%~97.5%和92.7%~98.2%,TTSuV1b的ORF1、ORF2序列与其他参考毒株间的核苷酸同源性分别为100%和97.1%~98.6%,分析表明其差异较小,亲缘关系较近。研究结果为四川省部分地区猪群中TTSuV1的流行情况提供数据参考,为进一步研究TTSuV的遗传进化提供一定的理论依据。

牛病毒性腹泻病毒1型灭活疫苗的制备及其免疫效果评价

为研究针对牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)毒株的灭活疫苗,选用本实验室分离的分离株SMU-Z6/1a/SC/2016和SMU-DJ2/1d/QH/2015与201佐剂制备BVDV水包油包水灭活疫苗免疫BALB/c小鼠或奶牛,并通过抗体中和试验、抗体交叉保护试验及ELISA方法对免疫后的抗体消长规律进行研究。结果显示,分离株SMU-Z6/1a/SC/2016制备的灭活疫苗免疫小鼠后产生的中和抗体相比分离株SMU-DJ2/1d/QH/2015制备的灭活疫苗高,最高值为1∶177;抗体交叉保护试验表明,SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫机体产生的抗体可以保护分离株SMU-DJ2/1d/QH/2015;而SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗免疫奶牛后抗体效价最高值为1∶1 413,且高于商品化疫苗组。基于分离株SMU-Z6/1a/SC/2016 E2重组蛋白建立的ELISA检测结果表明,SMU-Z6/1a/SC/2016灭活疫苗也能刺激机体产生较高水平的抗体,且整个试验过程中均高于商品化疫苗组,该结果与抗体中和试验结果一致。结果表明,以分离株SMU-Z6/1a/SC/2016制备的灭活疫苗可刺激不同动物机体产生高水平的中和抗体,这为我国BVDV灭活疫苗的研制和疫苗候选株的筛选提供了一定的数据支持和指导意义。