ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascu lar smooth musc le cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORC1基因表达抑制后VSMCs增殖的变化。方法实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性(ORC1+A、ORC1+B、ORC1+C)siR-NA组。应用W estern b lot检测ORC1基因表达的变化;应用MTT比色试验、3H-TdR掺入试验检测VSMCs增殖的情况。免疫细胞化学染色观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuc lear antigen,PCNA)表达。结果①siRNA转染后,3个阳性siRNA转染组ORC1基因表达水平均降低,尤以第2对阳性siRNA抑制效果最为显著,而空白对照组及阴性对照组间ORC1基因表达水平无显著差异。②siRNA转染使ORC1表达减弱后,VSMCs的MTT吸光度值3、H-TdR掺入量和PCNA表达量均较空白对照组及阴性对照组显著降低。结论RNA干扰介导的ORC1基因沉寂可显著抑制VSMCs增殖。

ORC1在大鼠血管平滑肌细胞G_1/S和S期的表达

目的检测大鼠血管平滑肌细胞(VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS,VSMCS)G1/S、S期中起始识别复合物(ORIGINRECOGNITION COMPLEX1,ORC1)的表达。方法采用组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉原代培养VSMCS。利用胸苷双阻断法造成细胞同步,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术、流式细胞仪检测分别测定G1/S、S期VSMCS的ORC1MRNA及蛋白表达。结果经光镜、免疫组化鉴定证实分离培养的细胞为VSMCS。ORC1MRNA在GO期的VSMCS无明显表达、G1/S期达到高峰,到S、G2/M期明显减少。流式细胞仪检测的VSMCS ORC1蛋白质表达与MRNA变化相似。结论ORC1可能在VSMCS细胞周期调节过程中起重要作用。

ORC1在大鼠血管平滑肌细胞增殖过程中的表达

目的检测不同增殖状态大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)中起始识别复合物1(origin recognition complex 1, ORC1)的表达.方法采用组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉原代培养VSMCs;提取细胞总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定不同增殖状态VSMCs中ORC1 mRNA表达;采用免疫荧光、激光共聚焦显微镜检测不同增殖状态VSMCs中ORC1 蛋白表达.结果经光镜、免疫荧光鉴定证实分离培养的细胞为VSMCs;处于静止状态的VSMCs无ORC1 mRNA表达,血清刺激6 h后ORC1 mRNA表达量明显增加,12～24 h达到高峰,继后逐渐减少;处于静止期的VSMCs无ORC1蛋白表达,处于增殖状态的VSMCs中有大量ORC1蛋白表达.结论 ORC1可能在VSMCs增殖过程中起重要作用.

ORC1与大鼠血管平滑肌细胞DNA复制的关系及意义探讨

目的 探讨大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖过程中DNA复制与起始识别复合物1（origin recognition complex 1，ORC1）基因表达的关系及意义。方法 采用组织块贴片法培养大鼠胸主动脉VSMCs，利用MTT法绘制生长曲线，分析不同生长状态VSMCs的DNA合成与ORClmRNA和蛋白表达的关系。结果 静止状态的VSMCs无ORC1 mRNA及蛋白质表达，血清刺激后12—24hVSMCsDNA的合成量显著增加，ORC1 mRNA及蛋白质表达量与VSMCs DNA的合成量相一致。结论 ORC1与大鼠VSMCs增殖过程中的DNA复制密切相关。

体外培养血管平滑肌细胞的同步方法

目的:探讨体外血管平滑肌细胞(VSMC)同步化的培养及意义。方法:采用组织块贴片法原代培养大鼠胸主动脉VSMC,利用双胸苷阻断和秋水仙素阻抑法使VSMC达到细胞周期同步化。结果:经鉴定培养的细胞为VSMC,采用血清饥饿法、双胸苷阻断法和秋水仙素阻抑法分别获得了处于不同细胞周期的同步化的VSMC:G0/G1期(89·22±3·54)%,G1/S交界期(66·74±7·16)%,S期(63·24±4·06)%,G2/M期(51·64±11·18)%。结论:同步了体外培养的VSMC,为研究冠状动脉粥样硬化的发病机制奠定了实验基础。

雷帕霉素对大鼠血管平滑肌细胞起始识别复合物1 mRNA表达的影响

目的观察血管平滑肌细胞(VSMC)起始识别复合物1(ORC1)mRNA在雷帕霉素作用下的表达变化。方法采用组织块贴壁法获得VSMC并用免疫细胞化学法鉴定,含体积分数10%血清的培养基培养。血清饥饿法饥饿细胞24 h使其同步化。将雷帕霉素加入含体积分数10%血清的培养基(终浓度为10 nmol.L-1)中继续培养细胞,分别于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h收集细胞,采用反转录-聚合酶链反应技术法检测各时间点ORC1 mRNA的表达(内参为β-actin)。用Quantity One软件计算各时间点ORC1 mRNA与内参的光密度比值,并作统计学分析。结果各时间点ORC1与β-actin光密度比值均有显著性差异(F=410.170,P=0.001)。雷帕霉素作用3～12 h ORC1 mRNA的表达持续升高(与0 h比较,P<0.05),12～18 h逐渐下降(与0 h比较,P依次为0.001,0.001,1.000),18～24 h与0 h比较,无统计学差异(P依次为1.000,0.986,1.000)。结论VSMC的ORC1 mRNA表达随雷帕霉素作用时间呈动态变化。

起始识别复合物1对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的起始识别复合物1(origin recognition complex1,ORC1)与血管平滑肌细胞增殖密切相关[1],文中探讨ORC1对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖活性的影响。方法用组织块贴片法培养大鼠胸主动脉VSMC;用流式细胞术测定VSMC静止期和增殖期的细胞周期,并计算出不同状态的增殖活性;用免疫荧光法测定ORC1在VSMC中的表达位置,用流式细胞术测定不同细胞周期中ORC1蛋白表达。结果静止期VSMC的增殖活性很低[(10.40±3.52)%],在VSMC中ORC1不表达或低水平表达。血清剌激24 h后,处于增殖期的VSMC的增殖活性明显增加,达(33.91±13.42)%,ORC1蛋白表达也明显增加(P<0.01)。结论 ORC1可能与VSMC增殖活性有关。

起始识别复合物1基因在血管平滑肌细胞DNA复制中的作用

目的探讨起始识别复合物1(ORC1)在血管平滑肌细胞(VSMC)DNA 复制中的表达及其意义。方法采用组织块贴片法原代培养的大鼠胸主动脉 VSMC,利用双胸苷阻断、秋水仙素阻抑法和血清饥饿法使 VSMC 达到细胞周期同步化,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和 Westernblot 检测不同细胞周期的 VSMC ORC1 mRNA 和蛋白表达。结果同步化的 VSMC DNA 含量百分比,血清饥饿法以 G_0G_1期为主(P<0.01),双胸苷阻断14 h 以 G_0G_1期为主(P<0.01),双胸苷阻断14 h 后10%胎牛血清刺激6 h 以 S 期为主(P<0.01),秋水仙素培养12 h 以 G_2/M 期为主(P<0.05)。静止状态 VSMC 的 ORC1 mRNA 和蛋白质无表达,处于 G_1/S 期 VSMC 的 ORC1 mRNA 表达量显著高于 S 期和 G_2/M 期。VSMC 的 ORC1蛋白质表达量与 ORC1 mRNA 变化规律相似。结论ORC1随细胞的分裂周期而表达,ORC1可能是启动 VSMC DNA 复制的关键因子。