重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究

目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显著(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。

幽门螺杆菌沙鼠感染模型的定量分析研究

目的 建立幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)蒙古沙鼠感染模型 ,并通过比较定量培养、快速脲酶试验和ELISA三种方法 ,确定Hp动物模型的最佳评判指标。方法 采用临床分离的Hp强毒株对 2 0只蒙古沙鼠进行感染 ,4周后剖杀。取血按常规ELISA法检测抗Hp抗体 ;分别剪取胃窦、胃体和胃底粘膜组织作定量培养 ;其余组织作快速脲酶试验及病理检查。结果 经定量培养结果显示沙鼠的Hp感染率达到 80 % (16/ 2 0 ) ,胃窦、胃体和胃底的Hp定植密度的对数均值分别为 5 2 4± 1 5 0、4 11± 3 2 2、和0 97± 2 3 9;16只Hp阳性沙鼠中脲酶试验有 4只阳性 ,ELISA有 7只阳性 ,阳性鼠的感染均值显著高于阴性鼠。结论 经筛选的Hp强毒株成功感染沙鼠后 4周 ,Hp主要定植于胃窦和胃体部 ;

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组亚单位疫苗FnBPA的免疫保护作用研究

目的评价耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)候选疫苗抗原FnBPA活性片段的免疫原性以及其在抵抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染中的免疫保护作用。方法构建pGEX-6p-2-FnBPA表达载体,经可溶表达及亲和纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠。末次免疫后的第7天,分离免疫小鼠的血清ELISA检测IgG及其亚型抗体水平,同时测定体外抗体介导的调理吞噬作用。末次免疫后的第14天,经尾静脉感染ATCC国际标准株MRSA-252,统计分析感染后各组的小鼠的生存率以及检测脾脏,肾脏的细菌定植量。结果成功构建、表达及纯化了FnBPA活性片段,重组蛋白纯度可达90%;免疫后诱导小鼠机体产生了高效价的IgG抗体,并在体外能发挥抗体介导的调理吞噬作用;在感染保护评价实验中,与对照组相比,实验组的生存率显著提高(P<0.01),并显著降低了脾脏与肾脏的细菌定植量(P<0.05)。结论耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗FnBPA具有良好的免疫原性和免疫保护作用,可以作为MRSA疫苗研究的重要候选抗原。

一种改良幽门螺杆菌液体培养方法

目的：探索一种简便的液体培养方法培养幽门螺杆菌（Ｈｐ）。方法：采用组织培养瓶，装少量含有１０％小牛血清、０．５％淀粉、１０ｍｇ／Ｌ万古霉素和２５００Ｕ／Ｌ多粘菌素Ｂ的脑心浸液肉汤，在厌氧罐中通过抽气换气建立微需氧环境，３７℃振荡培养，平板菌落计数法检测生长情况。结果：培养２４～４８ｈ，液体中活菌水平超过１０８ＣＦＵ／ｍｌ，涂片染色细菌形态典型。结论：此Ｈｐ液体培养方法简便可行，细菌生长良好，能满足对Ｈｐ的毒力因子。

乳香胶治疗幽门螺杆菌感染的实验研究

目的通过乳香胶对幽门螺杆菌(H P)的体外和体内试验来判定其疗效。方法用琼脂稀释法确定乳香胶对H P的最小抑菌浓度(M IC)及最小杀菌浓度(M BC),以H P感染沙鼠4周后给予药物治疗,疗程14d。结果乳香胶对H P M 13适用株的M IC为0.125m g m/L,M BC为0.5m g m/L;口服治疗7,14d及停药20d后H P清除率,3.75m g剂量组分别为25%,100%,25%,7.5m g剂量组分别为0,100%,50%,15m g剂量组分别为50%,100%,100%。结论乳香胶在体内和体外对H P感染都有效,但在体内试验中,停药后低剂量组有复发,可能是因为低剂量乳香胶只能抑制H P生长而不能完全清除细菌。

BalB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫应答

目的 评价重组尿素酶B亚单位 (rUreB)作为幽门螺杆菌 (Hp)口服疫苗成份的效果、探讨Hp的免疫保护机制。方法 采用重组Hp保护性抗原UreB与粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位 (CTB)共口服免疫BalB/c小鼠 ,ELISA分析血清、唾液和粪便、胃粘液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL 4、IFN γ的变化。结果 BalB/c小鼠口服rUreB和CTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。

CagA^+幽门螺杆菌裸鼠感染模型的建立

目的用携带ｃａｇＡ基因的Ｈｐ成功感染ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠。方法分别采用ｃａｇＡ基因阳性和阴性的具有较强动力的新鲜Ｈｐ分离菌株，通过灌胃方式感染ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠，感染后４周和８周分两批处死，进行微生物学和病理组织学检查。结果灌喂８周后，ｃａｇＡ＋实验组和ｃａｇＡ－实验组均成功定植Ｈｐ（１６／１６）；ｃａｇＡ＋组胃粘膜表现明显炎症及坏死病变，而ｃａｇＡ－组仅有轻微炎症发生。结论建立典型的Ｈｐ动物感染模型应选择ｃａｇＡ＋菌株。

沙鼠感染幽门螺杆菌后胃粘膜INF-γ、IL-4及IL-12p40表达水平的分析

目的通过比较幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染蒙古沙鼠前后胃粘膜INF-γ、IL-4及IL-12p40mRNA水平的变化,确定Hp感染在蒙古沙鼠胃粘膜诱发的免疫应答方式。方法采用临床分离的Hp强毒株对蒙古沙鼠进行感染,4周后剖杀。取胃粘膜组织作半定量RT-PCR检测INF-γ、IL-4及IL-12p40mRNA。结果与对照组相比,沙鼠感染Hp后,胃粘膜INF-γmRNA水平显著增加(P<0·05),IL-4mRNA水平显著降低(P<0·05),IL-12p40mRNA水平变化不显著(P>0·05)。结论Hp感染沙鼠诱导Th1型免疫应答,同时抑制Th2免疫应答,而对单核巨噬细胞的活化作用不明显。

幽门螺杆菌cagT蛋白的表达、纯化及免疫原性研究

为了解析cagT蛋白的结构,进而了解cagT基因在幽门螺杆菌致病中的作用,应用PCR技术从幽门螺杆菌26695菌株基因组中扩增cagT基因,T/A法克隆,连接至pET-28a(+)载体,转化宿主细胞E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫家兔制备抗体并鉴定其抗原性.成功克隆cagT基因,重组cagT基因片段的测序结果与GenBank上公布的序列相同.重组cagT蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,免疫家兔所得的抗体滴度为1∶32.结果构建了高效表达cagT蛋白的重组载体pET-28a(+)-cagT,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为后续的结构和功能研究奠定了基础.

壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球疫苗制备工艺研究

目的改变壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球制备中的各项参数,最终确认微球制备工艺。方法根据形成乳液的溶解性、流动性及黏稠度,选择微球制备过程中海藻酸钠(AGS)浓度及植物油与海藻酸钠的配比,通过比较形成微球的粒径大小,最终确定微球制备中CaCl2溶液的滴定程序及搅拌速率、搅拌时间等实验参数。结果确定了AGS乳液浓度为2%、植物油与AGS乳液配比为2∶8、CaCl2溶液反滴滴定法等MS制备工艺,并确定了搅拌速率800r/min、药物浓度2mg/ml、制备温度25℃、搅拌时间30min等参数。结论依照上述参数可以制备出符合实验要求的微球疫苗。

幽门螺杆菌对天然植物成分诱导耐药反应的实验研究

目的探讨幽门螺杆菌(HP)是否会对乳香胶、大蒜油和黄连提取物产生耐药。方法采用多步诱导法进行HP的体外耐药试验,另选临床耐药率很高的甲硝唑和目前抗HP疗效好的克拉霉素作同步试验;观察在药物浓度逐渐增加的培养基上转种的HP最低抑菌浓度(MIC)的变化,将敏感性下降的诱导株在无药培养基上转种3次后检测MIC值,测定乳香胶、大蒜油和黄连提取物对甲硝唑敏感性下降诱导株的MIC值。结果在多步诱导培养过程中,未诱导出对乳香胶、大蒜油和黄连提取物耐药的HP菌株,而在含64倍MIC甲硝唑的培养基上菌株仍能生长。在培养过程中,菌株对甲硝唑的敏感性逐渐下降,MIC值逐渐升高至64μg/mL;甲硝唑耐药株(MR)在无药培养基上转种10次后得到的MR'的MIC值不变。乳香胶、大蒜油和黄连提取物对MR的MIC没有影响。结论HP对乳香胶、大蒜油和黄连提取物不易产生耐药性,且甲硝唑耐药株对三者仍保持敏感。乳香胶、大蒜油和黄连提取物是有良好开发前景的抗HP感染的天然药物。

幽门螺杆菌感染小鼠及其抗原免疫小鼠后体液免疫应答的比较

目的 比较BALB/c小鼠感染H .pylori后以及经H .pyloriUreB抗原口服免疫后的体液免疫应答的差异。方法80只BALB/c小鼠分为感染组和免疫组。感染组灌喂H .pylori小鼠适应株 ;免疫组灌喂重组H .pyloriUreB抗原和佐剂LTB。在试验的 0、2、6和 10周时每组分别取 10只小鼠收集唾液及血液标本 ,用ELISA法检测抗UreBIgG和IgA抗体 ,同时采集胃组织作H .pylori感染检测。结果 感染组小鼠在灌喂H .pylori后 2、6、10周 ,感染率均为 10 0 % ,其血清中抗UreBIgG增高明显 ,但血清及唾液中均未见IgA的明显升高 ;免疫组小鼠在初次免疫后第 6、10周时 ,血清及唾液中抗UreBIgG和IgA抗体均显著升高。结论 H .pylori感染BALB/c小鼠不能诱导其产生明显的特异性黏膜免疫应答 。

不同预处理方法建立幽门螺杆菌感染动物模型的比较

目的 确定感染率高且稳定的幽门螺杆菌感染动物模型预处理方案。方法 取蒙古沙鼠200只,随机分为3个实验组及1个对照组。实验组沙鼠在断食、水12h后分别应用pH2盐酸、消炎痛+胃复安和50％乙醇3种不同方案进行预处理,对照组用生理盐水处理。此后继续断食、水12h,再灌喂Hp菌液（109cfu/ml）0.5ml/只。共3次,每次间隔12h。最后1次灌喂后2h给食、水。后每隔4周解剖一批动物,每组10只,进行分离培养、ELISA、PCR、快速尿素酶检测和病理切片检查。结果3组实验动物感染率不同,其中50％乙醇组沙鼠感染率相对较高,达到80％,其病理组织学变化与人体相应病变也极为相似。结论50％乙醇组沙鼠预处理方案感染效果最好,可作为Hp感染动物模型的预处理方法。

幽门螺杆菌改良无血培养基的研制

在无血脑心浸液卵黄琼脂培养基 （ＢＨＩＥＡ） 的基础上进行改良， 建立一新型快速、简便的幽门螺杆菌 （Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ， Ｈｐ） 无血脑心浸液卵黄琼脂培养基 （ＢＨＩＥＡ）。应用此改良培养基和含血脑心浸液培养基 （ＢＨＩＡ） 分别对８２例胃粘膜标本进行分离培养， 对两者在Ｈｐ 阳性培养率、分离时间及Ｈｐ 纯培养速度方面进行比较。改良培养基分离Ｈｐ 阳性率为７０％ （５７／８２）， 脑心浸液血培养基阳性率为６３％ （５２／８２）。采用改良培养基分离Ｈｐ 时间缩短近２４ ｈ， 纯培养时间缩短近１２ｈ， 且细菌各项检测指标典型。因此， 改良培养基更适用于Ｈｐ 的分离培养。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠全身感染模型的建立与评价

目的建立稳定、可靠的MRSA全身感染小鼠模型,为MRSA疫苗的研发提供参考依据,并对系统研究MRSA感染的发病机制及其防治策略奠定实验基础。方法在采用国际标准株MRSA-252建立OD600-CFU标准曲线的基础上,经尾静脉注射途径感染BALB/c小鼠,从感染剂量的选择、小鼠的生存率和体重变化、血液及多脏器的细菌定植量以及主要组织器官病理学变化等多个层面进行时相性监测,对建立的小鼠模型进行系统评价。结果经此途径建立的小鼠模型,致死剂量为每只5.0×109CFU,亚致死剂量为每只1.0×109CFU(生存率为60%～70%)。感染后小鼠生存率下降;体重下降;血液及肝脏、脾脏和肾脏均有细菌定植,定植量在感染后第3天达到高峰;心、肝、肺和肾等主要脏器中有较明显的细胞坏死和炎性细胞浸润。结论小鼠模型的建立,将为进一步研究MRSA疫苗的有效性和安全性评价等提供可靠的技术手段。

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因,并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果重组UreB在大肠杆菌中表达,相对分子质量约62 000,表达率26%,N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP,肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB/c小鼠,能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示,重组UreB具有良好的免疫原性和反应性,表现出与天然Hp UreB相似的生物学功能。结论为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。

蒙古沙鼠感染幽门螺杆菌后的胃部病理学变化研究

目的 建立幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)的蒙古沙鼠长期感染模型并观察其胃内的病理学改变。 方法 蒙古沙鼠 (8周龄 ) 80只 ,随机分为实验组 (40只 )和对照组 (40只 ) ,所有沙鼠禁食水 1d ,第 2天灌喂 5 0 %的乙醇 0 3ml,试验组第 3天及第 4天分 3次灌喂cagA+ Hp菌液 (10 9cfu/ml) ,0 5ml/只·次 ,对照组灌喂相同量无菌肉汤。最后一次灌喂后 2h进食水。距最后一次灌菌后 4、8、12、2 0、2 4周分别剖杀动物 ,每次实验组、对照组各 8只 ,进行微生物学检查 (粘膜涂片染色镜检、分离培养、快速尿素酶试验 )、血清学检查 (ELISA测抗Hp抗体 )和病理学检查。结果 实验组沙鼠在不同时间Hp感染率均达到 10 0 %。从第 4周开始 ,可见所有实验组沙鼠胃组织中有大量炎性细胞浸润 ,随着时间推移形成淋巴滤泡。部分沙鼠在第 12周后至 2 4周可见明显出血、慢性活动性胃炎及溃疡 ,有的溃疡可深达肌层。对照组沙鼠均无Hp定植及组织学病变。结论 蒙古沙鼠感染Hp后 ,可出现与人极相似的病理组织学改变 。

幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化

目的克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul)。方法采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414-ltB(AUL)。融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白。结果PCR扩增出1350bp的目的基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2+-NTA树脂提纯。纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上。Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性。结论成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性。

重组幽门螺杆菌AhpC基因的克隆表达及其初步纯化

目的克隆表达幽门螺杆菌(helicobacter pylori)AhpC基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌的疫苗保护性抗原奠定基础。方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出AhpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-11c中,重组载体pET-AhpC经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用阴离子交换层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR扩增的AhpC基因长度为597bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达98%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的28.7%,经纯化后,蛋白纯度达70%以上。Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应。结论成功构建了AhpC表达载体pET-AhpC,并在大肠杆菌中高效表达。

幽门螺杆菌微球疫苗非临床实验初步研究

目的:通过考察幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)微球生物学行为,探讨其作为口服蛋白疫苗的可行性。方法:用可降解天然高分子材料-壳聚糖和海藻酸钠制备Hp全菌蛋白微球(HpWCP-CAMS),通过BCA方法测定微球中蛋白质的包裹效率及包裹量,测定微球在体外的药物释放度。并进行小鼠体内微球的靶向试验,微球的体内外毒性试验和淋巴细胞致敏试验。结果:HpWCP-CAMS中蛋白包裹量为31.5%,蛋白包裹效率为61.0%。微球中药物缓释周期可长达20 d,靶向试验结果显示微球能在肠黏膜、PP结及脾脏富集并能有效诱导淋巴细胞致敏。体外毒性显示125μL微球(5 mg.mL-1)对Hela细胞生长无明显影响,体内实验结果显示其对小鼠生长也没有影响。结论:HpWCP-CAMS具有良好的靶向性和缓释特征,无细胞毒性,有望作为疫苗进一步研究。