CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展

当外源DNA通过转基因技术导入植物细胞后,会以同源重组或非同源重组两种不同的方式整合到基因组中,进而获得相应的目标性状。外源DNA与受体细胞序列相同或相近的位点发生重新组合,从而整合到受体细胞的染色体上称之为同源重组;当发生了DNA双链断裂的细胞为了避免DNA或染色体断裂而造成DNA降解或对生命力的影响,而强行将2个DNA断端彼此连接在一起时则为非同源重组。发生非同源重组的细胞其基因组常出现核苷酸片段的插入和/或缺失以及其他突变等多种情况,使得研究者无法得到精确控制的突变结果;而发生同源重组的细胞基因组序列通常不变,通过加入同源重组的供体DNA,可以实现对基因组的精确修饰和改造。由于在植物中产生自发同源重组的概率很低,对植物基因组进行精确修饰和改造非常困难,位点特异性核酸酶的出现和应用,大大提升了同源重组的效率,使基因组编辑变得更加高效和精确,从而使得对包括植物在内的任何物种进行基因组编辑都将成为可能。锌指核酸酶(ZFN)和TALE核酸酶(TALENs)是能够使DNA的靶位点产生DNA双链断裂进而实现基因组定点编辑的常用系统,但在具体应用中发现这两种系统存在着许多缺陷和不足,如脱靶效应、与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等,另外技术难度大、构建组装时间长也限制了其应用。CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中,是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统经过密码子优化等改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术,具有突变效率高、制作简单、易操作及成本低的特点。目前,该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑,编辑的类型包括基因的定点插入、小片段的缺失、多个位点同时突变、基因定点的indel突变等。目前,CRISPR/Cas系统在植物中的应用还比较有限,但该技术为植物基因工程的发展呈现了美好的前景。文中首先简要介绍了CRISPR/Cas系统的组成和基本原理,进而详细综述了该技术在植物内源基因和外源基因定点编辑中的应用,主要列举了自CRISPR/Cas系统改造成功以来利用该系统对单子叶和双子叶植物进行基因组定点编辑的案例,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望,希望能够为开展该领域研究的科研工作者提供参考。

盐碱胁迫下羊草消减文库的构建及分析

以盐碱胁迫下的羊草地上部分cDNA为实验方（tester）,非盐碱条件下生长的羊草地上部分cDNA为消减方（driver）,利用抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）构建了盐碱胁迫下羊草消减文库。从消减文库中筛选1920个阳性克隆,PCR鉴定插入片段大部分集中在300～800bp之间。将聚类后得到的552个非重复序列与GenBank中的序列进行比对,其中有548条与数据库中的序列有同源性,其中功能已知的339个,功能未知序列209条。获得了与盐碱胁迫相关的基因,如单脱氢抗坏血酸还原酶（MDAR）、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）、铁蛋白（Ferrtin）、水孔蛋白（PIP）、脱水素基因（dehydrin）、14-3-3蛋白等。本实验为抗逆基因的克隆及系统研究盐碱胁迫下羊草相关基因的表达奠定了基础。

羽衣甘蓝新品种‘红罗裙’和‘白罗裙’

观赏花卉羽衣甘蓝‘红罗裙’和‘白罗裙’均是利用自交不亲和系杂交而成。‘红罗裙’圆叶类型,成株心叶紫红色,边缘微皱。‘白罗裙’圆叶类型,着色早,心叶乳白色。两个新品种心叶颜色鲜艳、纯正,与外叶边缘绿色对比鲜明,株型整齐紧凑,观赏价值高,观赏期长,耐寒,性状稳定。

盐碱胁迫条件下羊草差异表达蛋白质组学的研究

为挖掘重要的抗盐碱相关基因,进而阐述羊草(Leymus chinensis)耐盐碱胁迫的分子机制,采用荧光双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)结合串联飞行时间质谱(MALDI TOF/TOF)方法,利用非盐碱条件下及Na_2CO_3处理下生长的羊草建立蛋白质表达谱,并进行差异蛋白质的分离鉴定。结果表明:2D-DIGE获得的74个差异蛋白点,其中蛋白质表达丰度上调的蛋白点44个,丰度下调点为30个,质谱鉴定显示其中33个蛋白质信息已知,参与了能量转换、代谢、光合作用、植物抗性和转录的过程。

二维液相色谱法在羊草地上部总蛋白分离中的应用

取8周龄羊草的地上部分,用三氯乙酸-丙酮法沉淀总蛋白,沉淀裂解后将缓冲液置换为起始缓冲液,进行第一维色谱聚焦分离。将第一维分离收集的pH值为8.5至4.0之间的组分分别进行第二维无孔硅胶反相高效液相色谱分离,利用ProteoVue软件获得羊草植株总蛋白pI/UV图谱,即羊草植株总蛋白质表达谱。文中对二维液相色谱法分离羊草蛋白质进行了方法学的研究,在第二维分离中尝试用3种不同的洗脱梯度条件进行分离,优化二维液相色谱分离条件并与传统凝胶双向电泳进行了比较,另外还对二维液相色谱的重现性和准确性进行了检验。实验建立了利用二维液相色谱分离羊草总蛋白的技术方法。

本硕博贯通人才培养模式下的科教融合教学实践——以“植物表观遗传学”课程为例

表观遗传学是遗传学的分支科学,在生命科学中取得了众多突破性研究进展,植物表观遗传学也涌现出大量前沿科研成果。植物表观遗传学知识体系庞大,学科知识点不断更新,学科交叉特征鲜明,知识框架亟待建设,授课模式亟待探索。在以“三大融合”为基础的加快构建国家急需人才培养新机制下,东北林业大学生命科学学院建立了本硕博贯通人才培养模式,针对学科特点和教学需求,进行了植物表观遗传学专业课程的科教融合式课程体系建设和教学实践,为高阶前沿型课程的建立、高质量科研型人才的培养提供参考和借鉴。

芸苔属自交不亲和细胞信号转导的研究进展

在芸苔属植物的自交不亲和细胞信号转导过程中,信号分子-SCR配体是由花粉粒产生的,被柱头乳突细胞SRK受体识别后,进行细胞内信号转导。这对受体-配体是两个由S位点编码的且高度多态的蛋白质,它们决定着自交不亲和反应。配体是位于花粉粒表面的一个小的胞被蛋白,由SCR基因编码;受体是位于柱头乳突细胞原生质膜上的跨膜的蛋白质激酶,由SRK基因编码。在自交授粉过程中,配体SCR和受体SRK的相互作用激活了受体SRK,被激活的SRK通过其下游组分ARC1介导底物的泛肽化,然后泛肽化的底物在蛋白酶体/CSN中被降解,从而导致了自交不亲和性反应。这些降解的底物可能是促进花粉水合、萌发和花粉管生长的雌蕊亲和因子。主要针对芸苔属自交不亲和细胞信号转导作一综述。

羽衣甘蓝自交不亲和系的选育及S_(13b)单倍型的鉴定

该文采用亲和指数法(种子数/自交授粉花朵数)分别在羽衣甘蓝‘赤兔’和‘白波’栽培品种的自交后代中,经过3年的自交选育获得1个自交不亲和系4·1·1和一个自交亲和系3·2·3·由于在芸苔属植物F1代杂交种的生产和自交不亲和分子机制的研究方面S单倍型鉴定是必要的,因此在该文中我们采用了PCR方法利用引物PK1和PK4获得了BoSRKx的基因组序列,此序列的大小为919bp.经过数据库检索比对后发现BoSRKx的序列与BoSRK13b的序列完全一致.通过反转录PCR的方法获得了BoSRKx的cDNA序列,结果发现BoSRKx和BoSRK13b的序列在转录水平上也是完全一致的;另一方面,我们采用SCR保守信号肽编码区和NotⅠ-oligo(dT)设计的引物获得了BoSCRx的cDNA序列,经过数据库的检索比对后发现BoSCRx的序列比BoSCR13的序列只多出3个连续的碱基.根据上述结果我们推断出Sx单倍型就是S13b单倍型;最后,通过遗传分析结合PCR-RFLP方法和DNAblot方法对自交不亲和系进行了S13b纯合体的鉴定.

植物抗逆反应中水孔蛋白的表达调控研究

水孔蛋白(aquaporin,AQP)作为一种功能性跨膜输水蛋白,对植物体形成水选择性运输通道并实现水分的跨膜运输起到重要的作用。当植物处于盐、干旱、低温等逆境胁迫状态时,体内的水分平衡被打破,水孔蛋白在水分运输和胞内渗透压的调控等方面表现出重要作用。综述了植物抗逆反应中水孔蛋白表达调控的研究进展。

高压静电场对羽衣甘蓝自交不亲和系种子基因组DNA甲基化的影响

DNA甲基化在植物的生长发育中具有重要的调控作用,它是植物正常生长发育所必需的。采用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术,以羽衣甘蓝自交不亲和系9#种子为研究对象,从表观遗传学的角度,对其生长发育过程以及高压静电场处理条件下基因组DNA甲基化水平及模式变化情况进行研究,探讨自交不亲和系种子退化现象与表观遗传规律的相关性。结果表明,自交不亲和系9#种子经高压静电场处理后,同时发生甲基化与去甲基化事件,以去甲基化为主。其中全甲基化水平略有升高,半甲基化水平下降明显,总甲基化水平下降;通过记录和计算种子在萌发过程中的各项指标,结果表明,高压静电场可促进9#种子的萌发和幼苗的生长发育,改善种子品质,表明高压静电场处理是恢复或延迟羽衣甘蓝自交不亲和系退化种子生长势,保持自交后代品质的有效手段之一。

MYB转录因子基因MIXTA及其同源基因功能的研究进展

被子植物表皮细胞的形态学建成是目前研究工作中较为流行的生物学现象,其大致包括:表皮细胞形状的改变、表皮细胞附属衍生物的形成、根毛和毛状体的分化等方面,根据大量的试验结果总结发现MIXTA及其同源基因的生物学功能与该现象密切相关。MIXTA是编码一个具有R2R3 MYB结构域的转录因子,自从1994年首次报道在金鱼草中被克隆以来,已经受到广泛的关注并在不同种属试验材料中被更深入地研究和讨论。MIXTA最早被证实的调节功能是促进金鱼草花瓣表皮细胞发生锥形化,使花瓣内表皮具有天鹅绒状质感,野生型金鱼草花瓣表面的锥形细胞在MIXTA突变时形状发生显著扁平化,花瓣内表皮的天鹅绒状质感消失,异位表达的MIXTA同时调控锥形细胞和多细胞腺体毛状体在不同组织部位的生长。近几年的研究发现,除金鱼草外,许多物种中都存在一些类似于MIXTA的基因,统称为MIXTA-like,如唐松草、猴面花、番茄、拟南芥等,特别是在拟南芥中,发现了很多与MIXTA具有高度相似性的基因,这些基因的功能与金鱼草中MIXTA的功能大同小异,并且对其下游基因的调节通路研究的较为透彻。同时,MIXTA作为MYB类转录因子可通过与b HLH转录因子及WD40转录因子结合发生互作,以复合物的形式间接地调控花青素的合成。MIXTA的存在可以影响花瓣表面的温度、气味、颜色、湿度、质感、光学特性等一系列生物学特征,并且通过改变植物花瓣的表型间接影响植物的授粉方式,建立自身的防御保护系统,由此体现MIXTA的生物学功能广泛,对其进行研究的生物学意义可见一斑。文章中首先简要介绍了MIXTA的基本结构,利用氨基酸序列比对及系统发生树等生物信息学技术比较分析MIXTA及其同源蛋白的亲源关系以及它们共同具有的R2R3 MYB结构域,然后从表皮细胞形状的改变(主要指表皮细胞锥形化)、表皮附属衍生物的形成(包括表皮蜡质的合成,毛状体和根毛细胞的分化)、参与激素代谢途径进而间接调控表皮细胞形态建成3方面来论述MIXTA及其同源基因的具体生物学功能,最后对MIXTA在农业、观赏园艺的应用及未来的研究方向进行了展望。

羊草脂氧合酶同源蛋白基因LcLHP的克隆与表达分析

为验证羊草脂氧合酶同源蛋白基因Lc LHP与盐胁迫的关系,利用RACE(Rapid amplification of c DNA ends)克隆技术从羊草中克隆得到抗盐碱相关基因脂氧合酶同源蛋白基因(LHP,Lipoxygenase homology protein)的c DNA全长序列,其Gen Bank登录号为KJ472894。Lc LHP基因开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Lc LHP中含有PLAT/LH2结构域,该结构域蛋白家族的许多成员受胁迫诱导。同源性分析显示,Lc LHP与互花米草PLAT/LH2家族蛋白脂氧合酶、PLAT植物胁迫结构域包含蛋白等同源性较高,蛋白功能预测显示其N端可能存在信号肽并可能具有酶功能。RT-PCR分析显示,在一定盐碱胁迫条件下,随着处理试剂Na2CO3溶液处理时间的延长,LHP基因在羊草中的表达量呈单峰趋势,在12 h时达到峰值;构建重组表达载体p GEX-Lc LHP并进行IPTG原核诱导表达培养,获得了GSTLc LHP融合蛋白并用GST抗体进行Western Blot试验得到验证。

激光对草原龙胆自交结实及自交后代幼苗生物量的影响

研究利用激光提高草原龙胆自交结实的方法,初步探讨了激光对花粉的生物效应。对草原龙胆的花粉进行激光照射,结果表明:适宜剂量的激光照射草原龙胆花粉,能够使其萌发率显著提高,并且使自花授粉的单朵花的结籽量也显著提高;自交后代植株的生长势有较大改善,幼苗健壮,植株的生物量也显著提高。从花粉的表面结构的电镜显微观察分析,激光照射后的花粉,其花粉壁的雕纹受到伤害,网脊线有些断裂,网眼变大,花粉管原始体变长。

羽衣甘蓝自交不亲和与自交亲和系种子萌发期DNA甲基化的动态变化

自交不亲和系植株的种子往往出现退化现象,为了研究种子的退化现象是否与甲基化相关,因此本文采用甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP）技术,以羽衣甘蓝自交不亲和系9^#种子、自交亲和系14~#种子为研究对象,对其生长发育过程种子基因组DNA甲基化水平变化情况进行研究。采用改良的CTAB法提取种子萌发不同时期DNA,然后通过MSAP分析、统计扩增条带,比较二者之间的差异。对9^#种子DNA甲基化状态分析表明,萌发前期（0-2 d）发生甲基化位点数目持续增多,但萌发后期（2-8 d）发生去甲基化的数目大量增加,整个萌发期去甲基化位点数目是甲基化位点数目的 11倍,说明9^#种子萌发过程中DNA甲基化修饰是基因表达的重要调控方式之一;在相同发育时期,9^#在总甲基化、全甲基化、半甲基化水平上均不同程度高于14^#。随着种子的萌发,9^#全甲基化水平明显上升,半甲基化水平几乎不变,而14^#变化趋势与9^#相反,半甲基化水平明显上升,全甲基化水平几乎不变。

激光、高压静电场克服羽衣甘蓝自交不亲和及其分子机制的研究

利用激光、高压静电场对自交不亲和的羽衣甘蓝的花粉进行处理,以期克服其自交不亲和。通过对处理后的花粉的表面结构和蛋白酶活性及其萌发情况的研究,进一步分析激光、高压静电场的生物效应。同时利用分子生物学手段Northern杂交技术,检测了经激光、高压静电场处理的花粉,在授粉后柱头上SLG和SRK基因表达的差异,以探讨激光、高压静电场对生殖反应作用的分子机制。结果表明:通过适宜剂量的激光、高压静电场处理,羽衣甘蓝的花粉萌发率提高,成熟花粉水溶性总蛋白,α-淀粉酶活力,总淀粉酶活力均不同程度的提高,同时自交亲和指数和结籽率提高。从花粉的表面结构的电镜显微观察分析,花粉壁的雕纹受到了伤害,网脊线有轻微断裂,网眼变大。授粉后,取不同时间间隔的柱头样品提取总RNA,利用Northern杂交技术检测SLG和SRK基因的表达量,授粉后24 h激光处理和高压静电场处理与对照比较,SLG和SRK基因的表达量均降低。

拟南芥中WRKY家族基因功能的研究进展

在植物体中转录因子通过与顺式作用元件相结合对功能基因进行转录调控,完成复杂的生命活动。文中综述了WRKY转录因子的特点及分类,以及拟南芥对环境胁迫进行应答过程中WRKY转录因子发挥功能的机制,为WRKY家族基因功能的进一步开发利用提供依据。

表观遗传修饰在作物重要性状形成中的作用

表观遗传修饰是指染色体DNA和组蛋白上的化学修饰,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。在不改变DNA序列的情况下,这些修饰可以通过改变染色质状态来影响遗传信息的表达,并具有可遗传性,对植物的生长发育具有重要的调控作用。当特定的表观遗传修饰发生改变时,农作物可以获得优异的表型、更强的环境适应性,因此人为改变表观遗传修饰有望获得更适于农业生产的优质种质资源。本文综述了植物表观遗传修饰的主要类型及其在作物重要性状的形成和环境胁迫响应中的相关研究进展,总结了表观遗传学应用于作物改良必须解决的主要问题,以期在表观遗传修饰层面为作物的育种改良提供新思路。

羊草铁蛋白基因(LcFER)全长cDNA的克隆及原核表达

羊草(Leymus chinensis)是东北地区盐碱地的乡土物种,蕴含着丰富且高效的抗盐碱特性相关基因。本试验利用RACE法从羊草中克隆了抗盐碱相关的铁蛋白基因(LcFER)的全长并进行了序列信息分析,并利用限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ构建了重组质粒pGEX-KG-LcFER。转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,用SDS-PAGE分析表达产物。结果表明:羊草铁蛋白基因(LcFER)编码区为729bp,与小麦、大麦、水稻等铁蛋白基因同源性较高,包含铁离子结合位点、铁核中心和铁离子通道3个保守的功能域,与亲缘关系较近的小麦和大麦的FER蛋白的二级结构一致。重组质粒pGEX-KG-LcFER经酶切和测序证实构建成功后,SDSPAGE分析诱导表达的蛋白质,获得的目标蛋白相对分子量为27kD左右。此结果为进一步研究铁蛋白基因的功能提供基础。

大豆OPR基因家族全基因组鉴定与表达分析

为了揭示大豆12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)家族成员GmOPRs在大豆生长发育中和非生物胁迫下发挥的作用,本研究运用生物信息学方法进行大豆OPR基因家族全基因组鉴定及表达分析。结果显示:大豆基因组中共有12个OPR家族基因成员,分布在8条不同染色体上。系统发育进化分析、基因结构分析和保守基序分析结果显示,GmOPRs可分为两个亚组,含有外显子4~5个,内含子3~5个,GmOPR蛋白之间保守基序分布相似。共线性分析鉴定表明共有4对基因存在共线关系,均为片段复制。GmOPRs启动子区域含有响应厌氧、干旱和低温等非生物胁迫以及JA、ABA等多种激素的顺式作用元件。不同的大豆品种及不同的组织中,GmOPRs的表达模式有差异。GmOPR1、GmOPR4和GmOPR9受干旱胁迫影响后表达量下降,GmOPR7、GmOPR8、GmOPR11和GmOPR12随着盐胁迫影响时间的增长表达量增加,表明GmOPRs基因通过多种表达模式响应干旱和盐胁迫。GmOPRs在系统发育进化和基因结构上比较保守,基因家族数量的扩增主要归因于片段重复。GmOPRs受干旱、盐胁迫等非生物胁迫的影响,表现出不同的表达模式,表明GmOPR基因家族可能在响应非生物胁迫中发挥重要作用。

草原龙胆雄蕊发育特定阶段差异蛋白质组学的初步研究

在高等植物发育过程中,会发生许多形态学和生理学特征上的改变。为了更好地研究草原龙胆特定发育阶段雄蕊内蛋白质组的差异,以草原龙胆栽培品系49号为试材,利用荧光差异双向电泳技术(2D-DIGE)研究了草原龙胆孢原细胞与小孢子母细胞的差异表达蛋白质组,分析了差异表达蛋白质在草原龙胆雄蕊发育过程中的可能作用。结果表明:利用De Cyder软件分析获得了72个主要差异蛋白质点,其中表达上调点为35个,表达下调点为37个。使用MALDI-TOF-TOF质谱仪对胶上消化后的差异蛋白点进行质谱分析,可信度达到90%以上的蛋白质点为15个,分别为5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、33 kDa光系统Ⅱ放氧复合体、核酮-1,5-二磷酸羧化酶、质体分裂环状蛋白、34 kDa的线粒体外膜膜孔蛋白、70 kDa热激蛋白、磷酸甘油酸激酶、蛋白水解酶复合体β6型亚单位、天冬氨酸蛋白酶、对ATP和Zn^(2+)依赖型金属蛋白酶和未知功能蛋白等。因此,在草原龙胆雄蕊发育的特定阶段由于蛋白质组的差异表达,导致雄蕊在形态学和生理学特征上发生改变。