一氧化氮对体外培养人表皮干细胞生物学行为的影响

目的观察外源性NO对人表皮干细胞（ESC）脱黏附、增殖以及迁移功能的影响。方法采用改良Ⅳ型胶原快速黏附法分离、培养人ESC，倒置相差显微镜下观察其形态；蛋白质印迹法和免疫荧光法观察ESC标志物整合素p，和细胞角蛋H 19（ CK19）的表达。对贴壁生长的ESC行划痕处理，用O（对照）、1、10、100、500 μmolL NO供体S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺（SNAP）作用细胞12、24 h，检测细胞迁移率；Transwe11实验检测SNAP（浓度同上）对ESC趋化能力的影响（计数转膜细胞）。采用0、10、100、500 μmolL SNAP作用细胞1 h，黏附实验检测SNAP对ESC黏附功能的影响，计算黏附抑制率；于上述4种浓度SNAP作用O（即刻）、12、24、48 h，采用酶标仪检测ESC增殖水平， 数据以吸光度值表示。对数据进行单凶素方差分析和Dunnett z检验。 结果 （1）倒置相差显微镜下可见，细胞培养5-9 d形成小克隆；培养10 -14 d，细胞增殖明显加快。蛋白质印迹法和免疫荧光法检测结果显示，所分离的细胞均能表达CK19和整合素p．。由此鉴定该细胞为ESC。（2）与O μmolL SNAP怍用12、24 h后细胞迁移率[（35.7±0.3）%、（45.7 ＋5.0）%]比较，1-100 μmolLSNAP均能促进ESC迁移，其中100 μmolL SNAP作用后细胞迁移率达峰值[（48.8±2.7）%、（82.1±15.8）%，P值分别为8. 34、5.10，P值均小于0.01]。100 y,mo1/L SNAP作用后转膜细胞数显著多于O μmolL SNAP作用后（t=9. 24，P=0.00）。100、500 μmolL SNAP作用后，ESC黏附能力明显低于OμmolL SNAP作用后（t值分别为4.30、4.67，P值均为0.00）。100、500 μmolL SNAP作用24、48 h，细胞增殖能力明显强于OμmolL SNAP作用后（t值为2.84-8.17，P值均小于0.05）。 结论适宜浓度的外源性NO对体外培养人ESC的迁移功能有促进作用。外源性NO对体外培养人ESC具有脱黏附、促增殖作用。

严重烧伤早期全身预防性使用抗生素研究进展

烧伤是一种平／战时均较为常见的损伤，严重烧伤的危害性大，病死率高。感染是烧伤患者最常见的并发症，发生率高达75％。严重感染是烧伤患者主要的死亡原因之一，研究显示，70％左右的烧伤死亡病例与感染相关。在烧伤，尤其是严重烧伤早期，临床上习惯常规全身性使用抗生素预防后续感染的发生。但各救治中心在烧伤早期全身性使用抗生素的种类与强度上各有其特点，目前并无统一的认识与方案。

成年大面积烧伤死亡患者的细菌感染及耐药情况分析

目的 分析成年大面积烧伤死亡患者的细菌感染及耐药情况. 方法 收集2002年1月-2012年12月第三军医大学西南医院全军烧伤研究所131例成年大面积烧伤死亡患者的临床资料,采用WHONET 5.5软件统计其中95例因出现严重细菌感染死亡患者住院期间血液、尿液、痰液、创面分泌物等标本来源的病原菌分布,以及常见革兰阳性菌和革兰阴性菌对哌拉西林、亚胺培南、复方磺胺甲唑、头孢哌酮等19种抗生素的耐药情况. 结果 (1)共检出病原菌189株,其中革兰阳性菌55株,占29.1％;革兰阴性菌134株,占70.9％;排名前5的菌株分别为铜绿假单胞菌67株、金黄色葡萄球菌43株、鲍氏不动杆菌15株、奇异变形杆菌13株、大肠杆菌9株.血液、尿液、痰液、创面分泌物来源的细菌均以铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌为主.(2)4种标本来源的金黄色葡萄球菌对万古霉素和替考拉宁均不耐药.血液、尿液、痰液来源的金黄色葡萄球菌对哌拉西林、头孢西丁、头孢哌酮、头孢噻肟、氨曲南完全耐药,除此之外,血液来源的金黄色葡萄球菌对奎奴普丁/达福普汀完全耐药,尿液来源的金黄色葡萄球菌对复方磺胺甲唑、奎奴普丁/达福普汀、利福平完全耐药,痰液来源的金黄色葡萄球菌对亚胺培南完全耐药;血液、尿液、痰液来源的金黄色葡萄球菌对其余抗生素的耐药率为33.3％～87.5％.创面分泌物来源的金黄色葡萄球菌对头孢西丁、头孢噻肟完全耐药,对其余抗生素的耐药率为60.0％～ 92.0％.(3)血液来源的铜绿假单胞菌对氨曲南、头孢他啶、多黏菌素B的耐药率为40.0％ ～ 66.7％,对亚胺培南、美罗培南的耐药率为72.2％,对其余抗生素的耐药率为83.3％ ～ 100.0％.尿液来源的铜绿假单胞菌对多黏菌素B不耐药,对其余抗生素的耐药率为80.0％～100.0％.痰液、创面分泌物来源的铜绿假单胞菌对多黏菌素B的耐药率为33.3％,对其余抗生素的耐药率为59.4％～100.0％.(4)铜绿假单胞菌对头孢他啶、美罗培南和多黏菌素B的耐药率为31.3％ ～67.2％,对其余抗生素的耐药率为73.1％ ～ 100.0％.鲍氏不动杆菌对左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南和美罗培南的耐药率为60.0％ ～ 73.3％,对其余抗生素的耐药率为93.3％ ～100.0％.除对头孢唑林耐药率较高外,奇异变形杆菌对其余抗生素的耐药率为23.1％ ～38.5％.大肠杆菌对丁胺卡那、美罗培南、多黏菌素B和亚胺培南不耐药,对头孢曲松、头孢唑林、哌拉西林完全耐药,对其余抗生素的耐药率为11.1％～50.0％.肺炎克雷伯菌对美罗培南、亚胺培南的耐药率为60.0％,对其余抗生素的耐药率为80.0％或100.0％. 结论 细菌感染是成年大面积烧伤患者死亡的重要原因;成年大面积烧伤患者感染以革兰阴性菌为主,易出现多药耐药菌及混合感染.

P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤及体外细胞创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响

目的观察P311在小鼠浅Ⅱ发烧伤技体外细胞创伤模型中对表皮干细胞（ESC）辽移的作用并探讨其机制。方法（1）取18只C57BL／6小鼠，其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤，于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织，各时相点3只；余下3只小鼠作为正常对照，同法取止常皮肤标本。采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶（SP）染色法观察P311在上述皮肤组织中的表达。（2）取6只新生的C57BL／6小鼠，连续3d腹腔注射50μg／g溴脱氧尿苷（BrdU，2次／（1）建立ESC示踪模型。7周后于其背部制作浅Ⅱ度烧伤创面。伤后72h取创面皮肤组织制作连续切片，SP法免疫组织化学染色，观察P311阳性和BrdU阳性细胞空间共定位情况。（3）构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋h（EGFP）及P311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFP-P311，并进行包装。应用Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养人ESC,按照随机数字表法将其分为P311高表达组和EGFP对照组，每组3孔，分别以pAdEasy-EGFP-P311及pAdEasy-EGFP腺病毒感染ESC。2组ESC经丝裂毒素C处理2h后行划痕实验。划痕后0（即刻）、24、48、72h测量地固定范围内划痕剩余面积，计算划痕愈合面积百分比。对数据进行独立样本t检验。结果（1）浅Ⅱ度烧伤后不同时相点，P311在创面不同部位的表达量各不相同。伤后创面毛囊、新生表皮巾P311表达量随时间延长逐渐上升；创用表皮及毛囊的P311表达量于伤后12h达高峰，72h回落至正常。（2）应用BrdU标记的小鼠浅Ⅱ度烧伤创Ⅲ新生表皮层可见P311阳性细胞和BrdU阳性细胞共定位。（3）划痕后48、72h，P311高表达组ESC划痕愈合面积百分比分别为（69±31）％、（89±26）％，明显高于EGFP刘照组[（35±12）％、（46±31）％，t值分别为-2．336、-2，611，P值均小于0．05]。结论P311可明显促进小鼠浅Ⅱ度烧伤创面及体外细胞创伤模型中的ESC迁移，可能在创面修复中起重要作用。

复合人表皮干细胞的猪脱细胞真皮基质对裸鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响

目的探讨复合人表皮干细胞(ESC)的猪脱细胞真皮基质(ADM)对裸鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法采用实验研究方法。采用数码相机拍照观察猪ADM形态,采用苏木精-伊红(HE)染色观测猪ADM中细胞残留,采用扫描电子显微镜观察猪ADM表面结构,采用红外光谱仪分析猪ADM二级结构,采用动态光散射粒度分析仪分析猪ADM粒径,采用纳米粒度电位仪分析猪ADM电位。采用倒置荧光显微镜观察猪ADM在培养基中放置30 min、1 d、5 d的形态(样本数为2);采用随机数字表法(分组方法下同)将猪ADM分为5 min组、10 min组、20 min组、30 min组、60 min组、120 min组,常温静置相应时间,称量法计算吸水量(样本数为3);将Swiss小鼠胚胎成纤维细胞(Fb)分为仅有培养基的空白对照组和另加入相应终质量浓度的ADM浸提液的50.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、6.5 g/L ADM浸提液组,分别于培养24、48、72 h,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖率并进行细胞毒性分级(样本数为5);将1只6周龄雄性SD大鼠红细胞分为生理盐水组、超纯水组及添加相应终质量浓度猪ADM浸提液的5 mg/mL ADM浸提液组、10 mg/mL ADM浸提液组、15 mg/mL ADM浸提液组,于反应3 h,采用酶标仪检测血红蛋白的吸光度值代表猪ADM血液相容性(样本数为3)。从陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院泌尿外科2020年7月收治的1名6岁健康男童包皮环切术后废弃包皮中分离培养ESC并采用流式细胞术鉴定。混合培养法构建复合ESC的猪ADM(以下简称ESC/ADM)颗粒,培养3 d后采用HE染色和激光扫描共聚焦显微镜观察ESC/ADM复合效果。将36只7~8周龄雄性无胸腺裸鼠分成单纯磷酸盐缓冲液(PBS)组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组,每组9只,并建立全层皮肤缺损创面模型,伤后即刻,创面均一次性采用相应试剂处理。分别于伤后1、7、11、15 d,观察创面愈合情况并计算创面愈合率(样本数为3);伤后7 d,行HE染色观察创面上皮化情况并测量未上皮化长度(此处及以下样本数均为4);伤后11 d,行Masson染色观察创面胶原沉积和真皮化情况并计算创面切面真皮面积,行免疫荧光染色并计算创面表达ESC特异性标志物CD49f的细胞数,行实时荧光定量反转录PCR检测创面移植ESC的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的mRNA表达。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、LSD-t检验。结果猪ADM为白色微粒状,内部无细胞存在,由网状结构组成,结构排列无序,表面粗糙;猪ADM分别在1659、1549、1239 cm^(-1)波数处出现吸收峰;猪ADM在溶液中主要粒径分布在500~700 nm;猪ADM表面带负电荷。放置30 min、1 d、5 d,猪ADM均形态相对稳定;放置30~120 min猪ADM吸水量保持相对高水平。6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组小鼠胚胎Fb在培养24 h细胞毒性分级为1级,其余各组各时间点细胞毒性分级均为0级。反应3 h,超纯水组红细胞中血红蛋白的吸光度值明显高于生理盐水组和15 mg/mL ADM浸提液组(t值分别为8.14、7.96,P<0.01)。第4代细胞常规培养3 d形态呈鹅卵石样且低表达CD71和高表达CD49f的被鉴定为ESC。猪ADM颗粒上有ESC附着、生长。伤后1 d,单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面大小基本一致。伤后7、11、15 d,各组裸鼠创面收缩,其中单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面收缩明显。伤后7 d,单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组(t值分别为2.83、4.72,P<0.05或P<0.01);伤后11 d,ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组(t=4.86,P<0.01);伤后15 d,单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率均明显高于单纯PBS组(t值分别为2.71、2.90、3.23,P<0.05)。伤后7 d,单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面未上皮化长度分别为(816±85)、(635±66)、(163±32)μm,明显短于单纯PBS组的(1199±43)μm(t值分别为5.69、10.19、27.54,P<0.01)。伤后11 d,单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面切面真皮面积明显大于单纯PBS组(t值分别为27.14、5.29、15.90,P<0.01);单纯ADM组和ESC/ADM组裸鼠创面的胶原生成比单纯PBS组明显,单纯ESC组和单纯PBS组相近。伤后11 d,单纯ESC组和ESC/ADM组裸鼠创面中CD49f表达阳性数量分别为(135±7)、(185±15)个,GAPDH的mRNA表达阳性;单纯PBS组、单纯ADM组裸鼠创面均无CD49f、GAPDH的mRNA表达。结论ESC/ADM颗粒能够促进裸鼠全层皮肤缺损创面愈合,这可能与其提高了ESC移植后的存活率和ADM促进了真皮结构重排、血管新生有关。

浅谈烧伤感染的分类与诊断命名

感染是烧伤最常见的并发症,是引起烧伤患者死亡的主要原因之一。因此,如何有效防治感染的发生发展是烧伤治疗的重要任务。临床上对感染尤其是烧伤感染的定义、诊断及救治仍存在较多的争议。该文作者就此提出了自己的观点与看法,希望能加深读者对烧伤感染的认识。