从腹泻实验兔分离的一株大肠埃希菌的生物学特性研究

目的研究从腹泻实验兔分离到的大肠埃希菌的生物学特性。方法对一株从因腹泻而死亡的SPF级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌的遗传谱系、抗生素敏感性、消毒液敏感性以及细菌携带的耐药基因和毒力基因进行较为全面的研究。结果该大肠埃希菌属于B1型遗传谱系,携带毒力基因eaeA,属于肠致病性大肠埃希菌。对常用的5种消毒液敏感,对于青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定、四环素、多西环素、米诺霉素、红霉素、麦迪霉素、万古霉素、复方新诺明等11种抗生素耐药,携带aadA1,gyrA,sul1和tetA等4个抗生素耐药基因。结论从因腹泻而死亡的SPF级实验兔体内分离的致病性大肠埃希菌为一株B1型遗传谱系的肠致病性大肠埃希菌,具有多重耐药性,对常用的消毒剂均敏感。

兔泰泽病原体实时荧光PCR检测方法的建立

目的 建立一种适用于兔泰泽病原体检测的实时荧光PCR检测方法。方法 根据泰泽病原体的16S rRNA序列设计了特异性的引物和探针,对引物和探针浓度进行了优化,并评价其敏感性、特异性和重复性。同时,使用该方法对临床样品进行了检测,并与已报道的套式PCR方法进行比较。结果 建立了能够特异检测泰泽病原体的实时荧光PCR检测方法,该方法检测质粒标准品的最低检测限为8 copies/μL,不与SPF级实验动物必须排除的多种细菌发生交叉反应,批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对70份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法。结论 建立的实时荧光PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,适用于兔粪球样本中泰泽病原体的检测。

柔嫩艾美耳球虫分离株对4种抗球虫药敏感性检测

为了探究北京地区3种柔嫩艾美耳球虫分离株S1、B4、DZ对磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶(预混剂)、磺胺氯吡嗪钠(可溶性粉)、地克珠利(溶液)、托曲珠利(溶液)4种药物的敏感性,从鸡只12日龄时开始,将鸡只分为16组,每组6只鸡,同时开始喂药直至试验结束(攻虫后第8天)。在鸡只14日龄时人工感染球虫4万个孢子化卵囊,该试验重复3次。结果得出S1 E.tenlla对磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶、磺胺氯吡嗪钠、地克珠利、托曲珠利4种药物均具有极强的耐药性。B4E.tenlla对磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶、磺胺氯吡嗪钠、托曲珠利3种药物敏感;对地克珠利具有耐药性。DZ E.tenlla对磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶和托曲珠利两种药物敏感,对磺胺氯吡嗪钠和地克珠利具有耐药性。

柔嫩艾美耳球虫分泌性蛋白生物信息学分析

为了分析柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)外分泌性蛋白的功能与结构以及预测其作为疫苗候选抗原的可能性,本试验将E.tenella第二代裂殖子与马-达氏牛肾细胞(MDBK细胞)通过Transwell小室进行无血清间接共培养12 h,收集培养液上清,利用液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)进行系列定性检测。将检测到的数据连接Mascot检索软件鉴定蛋白液中蛋白质的组成。运用生物信息学软件预测这些蛋白质的二级结构、跨膜结构域、亲/疏水性、信号肽、抗原表位和三维结构等。生物信息学分析得到的4种蛋白均无跨膜区,具有高疏水性,具有多个抗原表位,Hsp90和Histone 4存在信号肽,而HP和Ribosomal protein不存在信号肽。表明这些蛋白有潜在的免疫原性,可能成为柔嫩艾美耳球虫最为重要的潜在药物靶点或疫苗候选抗原。

鸡柔嫩艾美耳球虫HP基因的真核表达及其对鸡巨噬细胞凋亡的影响

HP基因编码蛋白是本实验室近期发现的一种鸡柔嫩艾美耳球虫的外分泌蛋白。本试验旨在构建重组荧光真核表达质粒pEGFP-HP,将其转染至细胞内,以此来分析HP基因对宿主细胞凋亡的影响。以柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子cDNA为模板进行PCR扩增,然后克隆至荧光真核表达质粒pEGFP,构建重组荧光真核表达质粒pEGFP-HP,将其转染至鸡巨噬细胞(HD11),42 h后采用流式细胞术检测宿主细胞凋亡情况。菌液PCR鉴定和测序鉴定结果显示,重组荧光真核表达载体pEGFP-HP构建成功。流式细胞术检测发现,pEGFP-HP重组质粒组的早期凋亡率显著高于pEGFP空质粒组和空白对照组(P<0.01)。结果表明柔嫩艾美耳球虫HP基因会促进HD11的细胞凋亡,尤其是早期细胞凋亡。本试验为进一步研究HP基因的生物学功能及其作用机制提供了依据,且将HP基因从此命名为柔嫩艾美耳球虫凋亡诱导基因(IA)。

3种检测布鲁氏菌荧光定量PCR方法的比较

为了筛选适用于家畜布鲁氏菌病检测的荧光定量PCR方法,合成目前报道最多的布鲁氏菌IS711插入序列、per基因和bcsp31基因的引物和探针,并分别对这3种荧光定量PCR方法的敏感性、特异性、重复性以及63份临床样品检测效果进行比较。结果显示:3种荧光定量PCR方法均具有较好的敏感性且均不与其他常见细菌发生交叉反应;3种方法的批内变异系数和批间变异系数均小于5%。在检测临床样品时,3种方法的敏感性均高于套式PCR方法,其中IS711荧光定量PCR方法与套式PCR方法符合率为95.24%,其他2种方法与套式PCR方法的符合率为98.41%。比较而言,IS711荧光定量PCR敏感性最高,更适合于布鲁氏菌核酸含量低的样品的检测。

基于纳米孔测序技术对兔腹泻病原的鉴定

为了探索纳米孔测序技术在动物传染病病原快速诊断中的应用价值,采集1只发生腹泻实验兔的肝脏和脾脏进行核酸提取、建库和纳米孔测序分析,同时对该腹泻的实验兔分别进行细菌分离鉴定和腹泻相关病毒的血清学检测。结果显示:纳米孔测序方法运行3 h后,获得1.9 GB的数据量,检出756521条序列,平均序列长度为2549.9个碱基。根据对测序数据的生物信息学分析表明,引起实验兔腹泻的病原可能为大肠杆菌。对同批送检的6只实验兔采用常规细菌分离鉴定方法在实验兔的心脏血样品、肝脏、肺脏和回盲部内容物中只分离到了大肠杆菌。对腹泻相关病毒的血清学检测结果显示6只送检的兔均为兔轮状病毒阴性。本研究采用纳米孔测序技术对发生腹泻的实验兔进行诊断,其结果与常规实验室检测方法获得的结果相符合,表明纳米孔技术在动物传染病病原快速检测中具有潜在的应用价值。

低温诱发肉鸡腹水综合征过程中缺氧诱导因子-1α的动态表达

【目的】通过测定环境低温诱发AS发生发展过程中缺氧诱导因子-1α表达的动态变化,初步探讨HIF-1α与AS发生发展之间的关系。【方法】100只商品代肉公雏,15d时随机分为常温对照组(22~24℃)和低温组(9~11℃)。各组在22、29、36和43d随机选取6只鸡,测定mPAP、AHI和心、肺组织中HIF-1αmRNA的表达量,试验结束后统计腹水发生率。【结果】低温组AS发生率(22%)显著高于对照组(4%)(P<0.05);低温组肉鸡mPAP和AHI显著或极显著高于对照组(P<0.05,P<0.01);低温组肉鸡心脏HIF-1αmRNA表达量显著或极显著(P<0.05,P<0.01)增加;肺脏HIF-1αmRNA表达量类似于同时间点的心脏。【结论】低温诱发AS发生过程中,肉鸡心脏和肺脏HIF-1α表达量明显增加,可能参与肉鸡AS的发生发展。

鉴别布鲁菌S2疫苗株的双重实时荧光PCR方法的建立与应用

为了建立一种鉴别布鲁菌S2疫苗株和其他种类布鲁菌的双重实时荧光PCR检测方法,通过查阅文献,分别设计了特异性扩增布鲁菌IS711插入序列和S2疫苗株缺失序列的2套引物探针,并对引物和探针浓度进行了优化,对其敏感性、特异性和重复性进行了评价,同时,使用该方法对不同类型的临床样品进行了检测。结果表明,用该方法对2种阳性质粒标准品的最低检测限均为10 copies/μL;该方法能特异性鉴别S2疫苗株,其他非布鲁菌的细菌核酸均未有特异性的扩增曲线;批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对112份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法,并可以成功对S2疫苗株的核酸进行鉴别。该研究建立的鉴别布鲁菌S2疫苗株的双重实时荧光PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,具有较好的临床应用价值。