外泌体在体外对乳腺癌细胞耐药信息传递的作用

目的探讨外泌体(exosomes,EXOs)在乳腺癌细胞间耐药信息的传递作用。方法选用乳腺癌敏感细胞株(MCF-7)及其阿霉素耐药株(MCF-7/ADR)为模型,用超速离心法提取MCF-7/ADR外泌体(ADR/EXO);用透射电子显微镜观察鉴定细胞外泌体形态;运用倒置荧光显微镜观察ADR/EXO与MCF-7细胞的相互作用过程;运用激光共聚焦显微镜观察MCF-7与MCF-7/ADR在Transwell小室共培养60h后细胞内阿霉素药物浓度变化;运用CCK-8法检测ADR/EXO与MCF-7细胞共培养后对阿霉素的IC50的影响;运用RT-PCR检测MCF-7与ADR/EXO共培养后MDR1基因表达水平的变化;运用Western blot法检测MCF-7与ADR/EXO共培养12h和72h后P-gp表达水平的变化。结果透射电子显微镜下,外泌体呈现典型的圆形或椭圆形杯口状结构,直径为40~100nm;用PKH67标记ADR/EXO显示,ADR/EXO是可以被MCF-7细胞摄取;与ADR/EXO共培养后敏感细胞株MCF-7对阿霉素的IC50耐药性升高2.62倍,差异有统计学意义(P<0.05);经过与MCF-7/ADR在Transwell小室中共培养60h后的MCF-7细胞,胞内可见阿霉素聚集减少,核区分布减少,荧光强度减弱;MCF-7+ADR/EXO组MDR1的mRNA表达量明显增加,是MCF-7组的8.69倍,差异有统计学意义(P<0.05);与MCF-7组相比,共培养12h的MCF-7+ADR/EXO组P-gp相对表达量升高4.64倍,差异有统计学意义(P<0.05);与MCF-7组相比,共培养72h的MCF-7+ADR/EXO组P-gp相对表达量升高3.37倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论乳腺癌外泌体可能具有传递耐药信息的作用,耐药细胞外泌体能够使敏感细胞获得一定的耐药性,耐药细胞外泌体向敏感细胞传递P-gp,不仅可以通过蛋白形式进行传递,而且可以通过mRNA的形式进行传递。

补骨脂素对乳腺癌干细胞拓扑异构酶Ⅱα表达的影响

目的探讨补骨脂素对乳腺癌干细胞拓扑异构酶Ⅱα(topoisomerase,TopoⅡα)表达的影响。方法选用乳腺癌多药耐药细胞株(MCF-7/ADR)为模型,用免疫磁珠法筛选乳腺癌干细胞;运用光学显微镜观察乳腺癌干细胞生长状态;用CCK-8法检测补骨脂素对乳腺癌干细胞的毒性作用以及阿霉素和阿霉素与补骨脂素联合用药组对乳腺癌干细胞的IC50,计算逆转倍数;运用RT-PCR检测拓扑异构酶Ⅱα基因mRNA表达水平;运用Western blot法检测拓扑异构酶Ⅱα蛋白表达水平。结果在光学显微镜下,乳腺癌干细胞呈球形生长;补骨脂素对乳腺癌干细胞的IC10为(6.77±0.23)μg/mL,IC20为(10.36±0.21)μg/mL;阿霉素对乳腺癌干细胞的IC50为(90.03±3.56)μg/mL,阿霉素与补骨脂素联合用药对乳腺癌干细胞的IC50为(21.47±0.82)μg/mL,逆转倍数为4.19倍;补骨脂素处理后,拓扑异构酶Ⅱα基因mRNA表达水平均升高,与对照组相比,6μg/mL组升高1.9倍(P=0.008,差异有统计学意义),10μg/mL组升高2.7倍(P=0.000,差异有统计学意义);补骨脂素处理后,拓扑异构酶Ⅱα蛋白表达均升高,与对照组相比,6μg/mL组升高1.8倍(P=0.003,差异有统计学意义),10μg/mL组升高2.4倍(P=0.000,差异有统计学意义)。结论补骨脂素能够上调乳腺癌干细胞拓扑异构酶基因和蛋白的表达,增加药物的作用靶点,逆转乳腺癌干细胞对阿霉素的耐药。

补骨脂素逆转谷胱甘肽-S-转移酶π介导的乳腺癌干细胞耐药性

背景:乳腺癌干细胞不仅导致乳腺癌的发生,还可能导致乳腺癌的转移及复发。干细胞与细胞耐药性的关系也受到人们越来越多的重视,把治疗的重点放到对干细胞的治疗上,可能会起到意想不到的结果。目的:探索补骨脂素对人乳腺癌MCF-7/ADR细胞中谷胱甘肽-S-转移酶π的逆转作用及机制。方法:(1)无血清培养基悬浮培养富集乳腺癌MCF-7/ADR干细胞群;(2)以RT-PCR和Western Blot检测0,4,8,12,16 mg/L补骨脂素对MCF-7/ADR干细胞中谷胱甘肽-S-转移酶π基因及蛋白表达水平的影响;(3)Western Blot技术检测0,8 mg/L补骨脂素处理前后核内核因子κB的活化状态;(4)RT-PCR技术检测18μmol/L SN50及8 mg/L补骨脂素对谷胱甘肽-S-转移酶π的表达水平;(5)CCK-8实验检测阿霉素对细胞增殖的影响。结果与结论:补骨脂素能显著降低MCF-7/ADR细胞中谷胱甘肽-S-转移酶π基因及蛋白表达水平,且补骨脂素能明显抑制核因子κB的活化。提示补骨脂素通过减少谷胱甘肽-S-转移酶π表达水平进而逆转人乳腺癌MCF-7/ADR干细胞多药耐药,其机制可能是通过抑制核因子κB信号通路来实现。