H9N2亚型猪流感病毒山东分离株的分离鉴定及其HA、NP、NS基因序列分析

从山东地区疑似流感发病猪分离到 10株流感病毒 ,经国家流感中心鉴定均为 A型流感病毒 H9N2亚型。将其中 1株 Sw/ SD/ 1/ 2 0 0 3(H9N2 )的血凝素基因 (HA)、核蛋白基因 (NP)和非结构蛋白基因 (NS)进行克隆与测序 ,与Gen Bank收录的其他猪流感和禽流感 H9N2亚型的相关基因进行比较 ,推测 Sw/ SD/ 1/ 2 0 0 3(H9N2 )可能源于禽流感病毒 H9N2亚型和 H5 N1亚型的重组病毒 ;Sw/ SD/ 1/ 2 0 0 3的 HA氨基酸裂解位点与其他 H9N2亚型不同 ,Sw/ SD/1/ 2 0 0 3的 HA氨基酸裂解位点是 R- S- L- R- G,而其他猪流感和禽流感 H9N2亚型都是 R- S- S- R- G。

中药产品甙肽对猪高热病防治效果分析

为找到一种有效防治猪高热病的方法,分别检测试验组和对照组猪血常规、血清生化指标、血清中细胞因子含量,以及甙肽产品对于预防和治疗猪高热病效果进行分析;结果表明,使用中药产品甙肽后,能够显著提高试验组猪的非特异性免疫力。进一步证明了中药对于预防病毒性疾病可以起到独特效果。

人源H3N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2005的分离鉴定及全基因遗传演化分析

2005年从广东某猪场采集疑似流感病猪的病料(气管和肺脏)样品共40份,通过MDCK细胞培养分离到6株A型流感病毒,经过血凝抑制和PCR扩增方法鉴定均为H3N2亚型。挑选其中一个代表株A/swine/Guangdong/1/05(H3N2)(SwGD1/05)进行全基因组测序并与GenBank中相关序列比较,结果发现SwGD1/05的8个基因分别与人流感病毒相关基因氨基酸同源性高达98.5%～99.4%;SwGD1/05的8个基因进化树中分别位于北美和欧洲人流感病毒进化谱系位置;由此推测SwGD1/05可能来源于北美或欧洲人源流感病毒株。这一结果为阐明猪作为流感病毒传播的中间宿主作用提供了的理论支持,本研究具有重要的人类公共卫生意义。

H1N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/06分离鉴定和对猪致病性研究

2006年5月从广东某大型猪场采集具有流感症状保育猪鼻拭子共98份,无菌常规处理猪鼻拭子后接种MDCK细胞,分离到4株流感病毒。用血凝抑制和PCR方法鉴定均为H1N2亚型。挑选其中一株A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2),进行全基因组测序,并与GenBank中相关序列进行比较。核苷酸同源性分析表明:A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2)与A/Swine/Guangxi/13/06不同基因之间同源性为96.6%～98.1%。以106EID50的剂量,将H1N2病毒鼻腔感染35日龄仔猪,结果表明H1N2亚型流感病毒可以感染猪上呼吸道,但不表现临床症状。本研究结果对于揭示H1N2亚型猪流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义。

A型猪流感病毒山东分离株鉴定及其HA基因序列分析

从山东各地疑似流感发病猪分离到10株流感病毒,经国家流感中心鉴定均为A型流感病毒H9N2亚型。将其中一株Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素全基因(HA)进行克隆与测序,与GenBank收录的其它猪流感和禽流感H9N2亚型的HA基因进行比较,发现Sw/SD/1/2003(H9N2)的血凝素基因在核苷酸序列方面同广西1999年分离的禽流感毒株Ck/GX/99(H9N2)和2000年云南分离的禽流感毒株Ck/YN/2000(H9N2)的同源性最高;进化树分析表明Sw/SD/1/2003(H9N2)起源于禽源的H9N2亚型流感病毒;Sw/SD/1/2003的HA氨基酸裂解位点与其他H9N2亚型不同,Sw/SD/1/2003的HA氨基酸裂解位点是R-S-L-R-G,而其它猪流感和禽流感H9N2亚型都是R-S-S-R-G。

现代规模化肉鸡养殖调查报告

规模化肉鸡养殖以其生长速度快、繁殖率高、抗病力强、饲养方便等优势逐渐成为一个新兴产业。中国的肉鸡产业经过多年发展，已经成为全球第二大肉鸡生产国，在竞争日益激烈的国际市场中占有重要地位。

鸭黄病毒巢式PCR检测方法的建立和应用

参照GeneBank已登录的黄病毒基因序列设计通用引物,建立基于黄病毒通用引物的巢式PCR检测体系,为黄病毒特别是新发黄病毒提供了高效的检测方法。该方法通过基因组的比对,选择NS5基因保守区设计了4条通用简并引物Flav P1～Flav P4,在此基础上建立了巢式PCR反应体系,并应用到鸭黄病毒的检测中。该体系仅能扩增鸭黄病毒目的基因而不能扩增其他病毒,且敏感性达到90copies.μL-1,比普通PCR高出1 000倍。同源性和进化分析表明,鸭黄病毒属蚊媒黄病毒类恩塔亚病毒群,与坦布苏病毒及近期发现的BYD病毒关系最近。以上结果表明,设计的黄病毒引物具有良好的通用性和特异性,其巢式PCR敏感性高,该体系成功地进行了鸭黄病毒的检测,验证了该方法的敏感性和特异性。

2008—2012年山东省鸡传染性支气管炎病毒遗传演化分析和致病性研究

本研究目的在于进一步明确山东省鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的流行病学和遗传演化规律。自2008—2012年从山东省发病鸡群中分离鉴定了20株IBV,并对其S1、N和M基因进行序列测定分析。在此基础上,选择3个代表性IBV流行株进行了致病性评价。结果显示:根据S1基因绘制的遗传进化树显示,20个IBV分离株和参考株形成4个进化分支。18个IBV分离株属于以QXIBV为代表的基因Ⅰ型,CK/CH/SD09/005和SDIB781/2012两个分离株与参考株形成独立的进化分支———基因Ⅳ型,与其它3个基因型IBV相似性仅为65.1%~67.1%。N基因和M基因序列分析结果显示,基因Ⅳ型分离株CK/CH/SD09/005和SDIB781/2012 N和M基因相似性仅为86.7%和87.9%,而SDIB781/2012 N和M基因分别与QX基因型分离株SDIB764/2012和SDIB702/2012 100%相似,表明2个基因型IBV流行株之间发生了基因重组。致病性试验结果显示,QX基因型分离株SDZB0808、SDIB821/2012和基因Ⅳ型分离株CK/CH/SD09/005对18日龄SPF鸡的致死率为60%~70%,病死鸡主要表现肾肿大和大量白色尿酸盐沉积于心、肾等器官表面,临床症状和病理变化基本一致。研究结果显示,山东省近年来IBV流行株优势基因型为QX,同时出现新型IBV流行株,2个基因型IBV均属于肾型传支。2个基因型IBV流行株之间通过基因重组不断进化,提示必须对IBV进行持续性的流行病学监测。

山东地区鸡传染性支气管炎病毒抗原相关性和血清分型

为进一步明确山东地区鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的流行病学,对IBV分离株之间以及与疫苗株之间的抗原相关性进行了分析。分别制备了3个疫苗株(4/91、H120和Ma5)和18个分离株的单因子阳性血清,通过鸡胚交叉中和试验测定了阳性血清对同源病毒和异源病毒的中和效价,计算了不同毒株之间的抗原相关系数(R值),并根据R值进行血清分型。结果显示,3个疫苗株和18个分离株可分为5个血清型。疫苗株4/91属于血清Ⅰ型,H120、Ma5与2个分离株(SDWF0608和SDLY0701)属于同一血清型,分离株SDZB0808与SDLY0702、CK/CH/SD08/007和CK/CH/SD09/001等15个毒株为同一血清型,CK/CH/SD09/006和CK/CH/SD10/001分别与其他3和6个分离株组成两个血清型。进一步分析发现,部分IBV毒株之间表现单向中和反应性,属于同一血清型的IBV毒株之间抗原相关性可能存在明显差异。本研究结果一方面表明IBV毒株之间复杂的抗原相关性,另一方面显示IBV流行株与3个疫苗株之间抗原性存在明显差异。

鸽源新城疫病毒全基因组序列分析及致病性研究

为了科学理解新城疫病毒(NDV)的遗传进化规律,对鸽源NDV基因组和致病特征进行了鉴定分析。从发病鸽群中分离鉴定1株NDV,命名为Pigeon/China/SDLC/2011,并对其进行全基因组测序分析和致病性评价。测序结果显示Pigeon/China/SDLC/2011基因组为15 192bp,具有NDV强毒株F蛋白裂解位点112 RRQKRF117。遗传进化分析发现Pigeon/China/SDLC/2011属于基因Ⅵ型,其6个结构蛋白氨基酸序列与基因Ⅶ型NDV参考株相比存在不同程度变异,其中P和HN蛋白相似性最低,分别为84.6%~84.8%和90.0%~91.1%。致病性试验结果显示鸽感染后表现瘫痪、翅膀下垂或斜颈等神经症状和排绿色稀粪,病死率为70%~80%;而SPF鸡感染后没有明显的临床症状。试验鸽喉头和泄殖腔病毒检出率明显高于试验鸡。本研究结果显示Pigeon/China/SDLC/2011在分子特性和对SPF鸡致病性方面与基因Ⅶ型NDV存在明显差异。虽然SPF鸡感染Pigeon/China/SDLC/2011后没有发病死亡,但可向体外排毒,因此必须采取有效措施防止鸽源NDV在鸽群和鸡群之间的相互传播。

禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用

根据禽呼肠孤病毒(ARV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验。该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199bp(ARV)、264bp(AIV)、362bp(NDV)和459bp(IBV),且特异性、敏感性良好,能够检出1pg AIV和10pg ARV、NDV、IBV的RNA。临床应用结果证明,该体系具有很高的实用价值和应用前景。

生物安全建设要以动物为中心

规模化养殖是畜牧发展的趋势,规模越来越大,设备也会越来越先进,同时地方畜禽品种也比较多,与此同时生物安全建设也存在一些问题。很多养殖场都认识到了生物安全的重要性,但怎么去落实生物安全,怎么去检验生物安全建设是否都做到位了还有待研究。其实很多发病的猪场或者鸡场都做了消毒、免疫和隔离,然而最后还是发病,到底是哪些环节的安全措施不到位。

新城疫病毒山东分离株F和HN基因克隆与进化分析

选取山东2007～2008年的5株NDV流行株,克隆融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因全长并测序。结果表明,5个分离株F基因长度为1662 bp,编码553个氨基酸。F蛋白裂解位点的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株F基因裂解位点的氨基酸序列特征。对F基因47～420 nt序列进行比对,发现4株鸡源毒株基因型为Ⅶd,另一鸽源毒株基因型为Ⅵ。5个分离株间F基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.8%～99.7%和94%～99.3%,与LaSota、Clone30、F48E9的氨基酸同源性分别为88.4%～89.5%、87.7%～88.8%、90.8%～92.4%。HN基因长度为1801bp,编码571个氨基酸,5个毒株均含13个半胱氨酸残基且位置保守。与LaSota的氨基酸同源性为87.2%～88.8%,与8个山东NDV流行株的同源性为89.8%～98.6%。

产蛋下降鸭群强毒新城疫病毒的分离鉴定与分子特征

从产蛋下降鸭群分离到两株新城疫病毒(NDV)(命名为Duck/China/SD6/2008和Duck/China/SD7/2009),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间为77.6h,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征。根据F基因(374bp)对2个NDV分离株和30个NDV参考株进行基因分型结果表明,2个分离株均属于基因Ⅶ型。F基因和HN基因核苷酸序列同源性比较显示,2个鸭分离株与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为94.1%～99.7%和94.4%～97.1%,与同期分离的鸡源NDV强毒株Chicken/China/SD4/2008同源性最高,分别为99.3%～99.5%和99.5%～99.7%,表明这两个鸭NDV毒株可能来源于感染NDV的鸡群。

规模化肉种鸡场新城疫和禽流感带毒监测与抗体检测研究

为了了解规模化养殖模式下鸡群新城疫和禽流感带毒情况和抗体滴度,从2007年9月~2008年8月,对规模化养殖场肉种鸡定期进行新城疫和禽流感带毒监测和抗体检测。每月采集鸡群气管和泄殖腔棉拭子各30份（抽检率0.3%）进行新城疫和禽流感病毒监测,每2周采集30份血样（抽检率0.3%）进行新城疫和禽流感抗体检测。研究结果显示,监测鸡群从进雏到淘汰未发现新城疫和禽流感病毒感染 从6.5周龄开始,鸡群新城疫和禽流感（H9亚型）抗体一直维持在免疫保护临界值以上,比较之下,禽流感（H5亚型）抗体上升较慢,且滴度比H9低（2~4）log2。

基因Ⅶ型新城疫病毒对鸭和SPF鸡致病性比较研究

旨在研究基因Ⅶ型新城疫病毒（NDV）对鸭的致病性，以明确鸭在NDV流行病学中的作用。选取2株鸭源基因Ⅶ型NDV流行株，以0．2和0．5mL剂量分别通过滴鼻或肌肉注射对商品鸭进行人工感染试验，同时用0．1mL剂量通过滴鼻感染SPF鸡。SPF鸡用2株NDV攻毒后表现气喘、流涎和排绿色稀粪等症状，并于3～6d100％发病死亡，而鸭用2株NDV攻毒后未见明显发病死亡。SPF鸡攻毒后喉头、泄殖腔棉拭和内脏组织病毒分离率明显高于试验鸭。病理组织学检查发现SPF鸡感染NDV后可见非化脓性脑炎、间质性肾炎和肺炎、明显的消化道和呼吸道炎症，而试验鸭仅呼吸道和消化道组织表现轻度炎症。本研究结果表明2株基因Ⅶ型NDV强毒对鸭无明显致病性，但鸭感染后NDV强毒后可以通过喉头或泄殖腔排毒，因此必须采取有效措施以防止NDV在鸡群和鸭群之间相互传播。

鸡三种天然免疫相关受体和配体荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测鸡天然免疫相关受体(Ch-MDA5、Ch-TLR3和Ch-TLR7)及其相应配体(MAVS、TRIF和MyD88)的荧光定量PCR方法并评价其应用效果,设计和筛选特异性PCR引物,制备各基因的质粒标准品,绘制荧光定量PCR的标准曲线,并对方法的灵敏度、重复性和特异性进行检验。结果表明,所建立的检测方法敏感度高、特异性强、检测线性范围广、重复性好。应用建立的方法检测新城疫油乳剂灭活苗免疫SPF鸡后上述基因表达的变化,发现免疫后6h各基因的表达水平达到峰值,表明疫苗免疫迅速有效地激活了机体的天然免疫应答。建立了与鸡抗病毒感染天然免疫相关的3种细胞受体和相应配体的定量检测方法,可应用于病毒致病机制、鸡用新型疫苗、免疫增强剂以及抗病毒药物的研究与开发。

猪细小病毒SD-68株NS1基因的克隆与序列分析

对猪细小病毒(PPV)SD-68株NS1基因进行了克隆和序列测定,结果表明SD-68株NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸组成的多肽。该序列与PPVSY-99株、Kresse株、NADL-2(5075)和NADL-2(4973)株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.9%、99.9%、99.7%、98.1%,氨基酸的同源性分别为99.7%、99.5%、99.5%、96.7%。PPVSD-68株与MVM(i)、MEV(Abashiri)、CPV、FPV、BPV3、GPVNS1的进化树分析表明:PPVSD-68株NS1与MVM(i)NS1亲缘关系最近,与BPV3NS1的亲缘关系最远;在Thr435和Ser473位点PPVSD-68株与MVM(i)完全一致,表明Thr435和Ser473是PPVSD-68株NS1潜在的磷酸化位点。

羊白细胞介素-18成熟蛋白的酵母表达和生物学活性研究

为了研究重组羊白细胞介素(gIL)-18在酵母系统中的高效表达,进一步阐明该重组蛋白的生物学活性,以含有gIL-18基因的重组质粒为模板进行PCR扩增,构建重组表达质粒pPICZ-gIL-18,转化于毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达,经SDS-PAGE和western blot分析证实了重组蛋白的表达,分泌的重组gIL-18表达量为100mg/L。经纯化后用MTT法和MDBK-VSV法检测表达的重组IL-18体外生物活性,利用免疫试验检测了重组蛋白对羊痘疫苗的免疫增强作用。实验结果表明,该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性,比活性为1.5×105u/mg。体外具有增强羊痘疫苗的活性。毕赤酵母分泌表达的重组gIL-18具有良好的生物学活性,为gIL-18作为免疫佐剂和免疫治疗剂的大规模应用奠定了基础。