鼠抗人CMTM7单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备鼠抗人CMTM7（CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 7）蛋白的单克隆抗体，探讨CMTM7蛋白的分子结构和生物学功能。方法：通过生物信息学对CMTM7的蛋白序列进行分析，选取了3段序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，混合后免疫Balb／c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2／0进行常规融合，间接ELISA方法进行筛选和有限稀释克隆化，获得鼠抗CMTM7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用Westernblot、免疫荧光以及免疫细胞化学等方法对其特性进行鉴定。结果：成功地建立了2株稳定分泌抗CMTM7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为MC9和2C9，其免疫球蛋白亚类均为IgG1。MC9单抗识别的抗原表位位于CMTM7氨基酸残基163～175区域（CMTM7163-175），可用于Western blot、免疫荧光和免疫细胞化学分析（immunocytochemistry，ICC）。2C9单抗识别的抗原表位位于CMTM7氨基酸残基19～44区域（CMTM719-44），该单抗只能用于Westernblot分析。初步的功能研究提示，CMTM7蛋白在植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）活化早期的外周血淋巴细胞中表达上调。结论：获得了特异性好、能够识别不同抗原表位以及不同用途的鼠抗人CMTM7蛋白的单克隆抗体，为研究CMTM7蛋白的分子结构以及功能特性奠定了基础。

PDCD5、MDM2、Tip60和P53在食管鳞状细胞癌中的表达及其相关性

目的探讨PDCD5、MDM2、Tip60和P53在新疆食管鳞癌患者的癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达及相关性。方法 RT-PCR检测PDCD5、MDM2和Tip60 mRNA表达;免疫组织化学法检测PDCD5、MDM2、Tip60和P53蛋白的表达(18例哈萨克族、22例汉族)。结果癌组织中PDCD5、MDM2和Tip60 mRNA的阳性率为80.0%、65.0%和97.5%,MDM2 mRNA在癌组织中阳性率高于正常和癌旁组织(P<0.05);半定量RT-PCR结果显示癌组织PDCD5、MDM2、Tip60 mRNA低于正常组织(P<0.05)。癌组织PDCD5、MDM2和P53蛋白表达率低于正常组织(P<0.05);癌组织中PDCD5蛋白的阳性表达与分化程度有关(P<0.05);PDCD5与MDM2 mRNA、Tip60与P53蛋白在癌组织中的表达有相关性(P<0.05)。结论 PDCD5、MDM2、Tip60和P53四者之间可能存在共同的激活机制,构成了肿瘤细胞凋亡的多种途径。

抗人PDCD10单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备鼠抗人程序性细胞死亡分子10(programm ed cell death 10,PDCD10)的单克隆抗体,探讨PDCD10蛋白的结构和功能。方法:利用重组PDCD10蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗PDCD10蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过ELISA,W estern b lot和免疫荧光实验等方法对其特性进行鉴定。结果:成功地建立了3株稳定分泌抗PDCD10蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5G1,4F7和3H5。3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1(4F7和5G1)和IgG2b(3H5)。ELISA检测的单克隆抗体腹水效价可达1∶107。3株单克隆抗体与重组PDCD10蛋白有较强的特异性反应,而与大肠杆菌细胞裂解液以及谷胱苷肽-S转移酶(glutath ioneS-transferase,GST)没有交叉反应。同时,5G1单克隆抗体也能特异性地结合真核细胞内源性和超表达的PDCD10蛋白,免疫荧光竞争结合实验以及W estern b lot的结果证明3株PDCD10的单克隆抗体能够识别不同的抗原表位,内源性以及超表达的PDCD10蛋白主要定位在细胞核。结论:获得了效价高、特异性好的PDCD10蛋白的单克隆抗体,为PDCD10的生物学功能研究奠定了基础。

小鼠抗人磷脂酰肌醇3激酶相互作用蛋白1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备鼠抗人磷脂酰肌醇3激酶相互作用蛋白1(PIK3IP1)的单克隆抗体(mAb),探讨PIK3IP1蛋白的结构和功能。方法:利用重组蛋白GST-PIK3IP162-168为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过间接ELISA的筛选和有限稀释克隆化,获得鼠抗人PIK3IP1蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA,Westernblot和免疫荧光技术等方法对其特性进行鉴定。结果:成功地建立了1株稳定分泌抗PIK3IP1蛋白的mAb杂交瘤细胞株,命名为5C6,其免疫球蛋白亚类为IgG1。ELISA检测的腹水效价可达1:107。5C6mAb与重组GST-PIK3IP162-168蛋白有较强的特异性反应,而与大肠杆菌裂解液以及谷胱苷肽2S转移酶(GST)没有交叉反应。同时,5C6mAb也能特异性地结合真核细胞超表达的全长PIK3IP1蛋白和变异体PIK3IP1-v1,但检测不到内源性的PIK3IP1蛋白。共聚焦免疫荧光显微镜结果显示PIK3IP1和PIK3IP1-v1定位于胞质,在胞质中呈现不均一的斑点状分布。结论:获得了效价高、特异性好的PIK3IP1蛋白的mAb,为进一步研究PIK3IP1的生物学功能提供了有用的工具。