MnTMPyP通过抑制氧化应激和内质网应激减轻百草枯致肺上皮细胞损伤

目的探讨锰(Ⅲ)-四(4-N-甲基吡啶基)卟啉(MnTMPyP)对百草枯(PQ)致肺上皮细胞损伤是否具有保护作用及相关机制。方法体外培养人肺泡Ⅱ型上皮样细胞A549细胞,以超氧化物歧化酶的模拟物MnTMPyP为干预因素。实验分为4组:对照组,加入RPMI 1640培养液;MnTMPyP组,加入MnTMPyP 10μmol/L;PQ组,加入PQ 750μmol/L;PQ+MnTMPyP组,MnTMPyP10μmol/L预处理90 min,再加入PQ 750μmol/L。各组细胞处理24 h后检测相关指标。MTT法检测细胞活性;流式细胞术检测活性氧(ROS)、细胞质内Ca^(2+)水平;紫外比色法检测谷胱甘肽还原酶活性;Western blotting检测内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78(Grp78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白的表达。结果与对照组相比,MnTMPyP组检测指标的变化无统计学意义;PQ组细胞活性降低,ROS产生显著增加,细胞质内Ca^(2+)水平明显升高,谷胱甘肽还原酶活性明显降低,Western blotting显示内质网应激蛋白Grp78、CHOP表达量均显著增加。与PQ组相比,PQ+MnTMPyP组细胞活性增加,ROS产生减少,细胞质内Ca^(2+)水平降低,谷胱甘肽还原酶活性增加,Grp78、CHOP蛋白表达量均显著减少。结论 MnTMPyP有效减轻PQ诱导的肺上皮细胞损伤,其机制与拮抗PQ引起的氧化应激和内质网应激有关。

MnTMPyP通过抑制线粒体凋亡通路对百草枯诱导肺上皮细胞损伤的保护作用

目的探讨MnTMPyP（Mn）通过抑制氧化应激和线粒体凋亡通路对百草枯（PQ）诱导肺上皮细胞损伤的保护作用。方法体外培养人肺泡Ⅱ型上皮样细胞A549细胞，以超氧化物歧化酶（SOD）的模拟物Mn为干预因素。实验分为四组：①对照组：加入RPMI1640培养液；②Mn组：加入Mn10μmol／L；③PQ组：加入PQ750μmol／L；④PQ＋Mn组：Mn10μmol／L预处理90min，再加入PQ750μmol／L。各组细胞处理24h后检测相关指标。MTT法检测细胞活性；流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、活性氧（ROS）；分光光度法检测Caspase-3；Western blotting检测线粒体凋亡蛋白Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果与对照组比较，Mn组检测指标无统计学意义；PQ组细胞活性降低，细胞凋亡率增加有统计学意义（P〈0．01），线粒体膜电位降低有统计学意义（P〈0．01），ROS的产生显著增加，Caspase-3活性增高，Western blotting显示线粒体凋亡途径中抗凋亡蛋白Bcl-2表达量降低，促凋亡蛋白Bax表达增强。与PQ组比较，PQ＋Mn组细胞活性增加，细胞凋亡率降低，线粒体膜电位增强，ROS的产生减少，Caspase-3活性降低，Western blotting显示Bcl-2蛋白表达量增强，Bax蛋白表达降低。结论Mn有效减轻PQ诱导肺上皮细胞的损伤，其机制是和拈抗PQ引起的氧化应激诱导的线粒体凋亡途径有关。

丝裂原活化蛋白激酶通路在百草枯诱导人肺Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡中的作用

目的探讨百草枯(PQ)诱导人肺Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡过程中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的作用及其机制。方法通过PQ(200μmol/L)诱导A549细胞凋亡,选择c-JunN-末端激酶(JNK)MAPK特异性抑制剂(SP600125)与P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)特异性抑制剂(SB203580)阻断相应MAPK通路。实验分为对照组、SP600125组、SB203580组、PQ组、SP600125+PQ组、SB203580+PQ组。各组细胞孵育48h后,MTT法分析细胞活性;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;采用检测试剂盒测定Caspase-3和Caspase-9活化程度;Western blotting检测MAPK与线粒体凋亡信号转导通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,SP600125组与SB203580组各项检测指标比较差异无统计学意义(均P>0.05);与PQ组比较,SP600125+PQ组与SB203580+PQ组均显著提高了细胞活性、降低了细胞凋亡率、降低了Caspase-3和Caspase-9活化程度、降低促凋亡蛋白Bax表达和促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达(均P<0.05);同时SP600125+PQ组降低p-JNK/JNK蛋白表达比例;SB203580+PQ组降低p-P38/P38蛋白表达比例(均P<0.05)。结论PQ通过MAPK途径诱导人肺Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡。

百草枯通过激活线粒体凋亡通路诱导人肺Ⅱ型上皮样A549细胞凋亡

目的探讨百草枯(PQ)诱导人肺Ⅱ型上皮样A549细胞凋亡过程中线粒体凋亡通路的发生机制。方法体外培养A549细胞,对照组加入RPMI 1640培养液,实验组加入不同浓度的PQ(50、100、150和200μmol/L),2组细胞继续培养24和48 h。MTT法检测细胞活性;Hoechst 33258染色法观察细胞核的形态;流式细胞术检测细胞凋亡率以及线粒体膜电位;分光光度法检测caspase-3和caspase-9的活化程度;Western blotting检测线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-x L、Bax和Bak的表达。结果 MTT结果显示,PQ对A549细胞具有显著的生长抑制作用。Hoechst染色显示,不同浓度的PQ作用于A549细胞24和48 h后,可发现细胞凋亡的特征性改变,如细胞核固缩、核碎裂、凋亡小体形成,并且细胞的凋亡程度随着PQ浓度的增大和作用时间的延长而加重。细胞凋亡率升高也证实了这一结果。线粒体膜电位出现不同程度的降低;caspase-3和caspase-9活性不同程度的增加;抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x L的表达量降低;促凋亡蛋白Bax、Bak的表达量升高。以上结果均呈时间与浓度依赖性。结论 PQ通过激活线粒体凋亡通路诱导A549细胞凋亡。

内质网应激途径在百草枯诱导人肺Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡过程中作用

目的探讨百草枯(Paraquat,PQ)诱导人肺Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡过程中内质网应激途径的发生机制。方法体外培养A549细胞,以PQ为处理因素,建立PQ诱导A549细胞发生ERS的模型:对照组(等量PBS)、PQ250μM组、PQ500μM组、PQ750μM组、PQ1000μM组。处理24h后利用MTT法测定细胞生存率,应用光学倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学变化,采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡比例,在筛选出的凋亡率最高的PQ500μM组中,采用分光光度法测定Caspase-3的活化程度,并提取总蛋白,采用Western blotting试验方法检测内质网应激(ERS)通路相关蛋白GRP78、PERK、p-PERK、ATF6、c-ATF6、IRE1α、pIRE1α和CHOP的表达变化。结果 PQ处理细胞24h后,随PQ浓度增高,A549细胞生存率逐渐下降,细胞形态发生显著变化。在PQ(500μM)组,细胞凋亡率达到最高,Caspase-3活性显著增加,GRP78和CHOP蛋白表达量随诱导A549细胞时间延长显著增加,p-PERK,c-ATF6和p-IRE1α的表达量在6h时显著增加。结论 PQ可以通过激活内质网应激途径引发人肺Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡。

百草枯经P53介导的线粒体凋亡途径诱导人肺Ⅱ型上皮样细胞A549凋亡

目的:探讨百草枯(PQ)诱导人肺Ⅱ型上皮样A549细胞凋亡过程中P53的作用及其作用机制。方法:实验分为对照组、PFT-α预处理组、PQ处理组和PFT-α预处理+PQ组。各组细胞培养24h、48h后,检测细胞凋亡、线粒体膜电位、Caspase-3/-9活性以及P53、Bax、Bcl-2蛋白表达的改变。使用P53依赖的转录抑制剂PFT-α来评价P53的作用。通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率以及Rh-123染色法检测线粒体膜电位;采用检测试剂盒测定Caspase-3和-9的活化程度;Western Blot检测P53、Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:与PQ处理组比较,PFT-α预处理+PQ组显著减弱了PQ诱导的细胞凋亡,抑制了线粒体膜电位的降低,降低了Caspase-3和-9的活化程度、P53蛋白的表达以及Bax/Bcl-2相对蛋白水平比例。对照组与PFT-α预处理组各方面比较差异无统计学意义。结论:PQ可通过P53介导的线粒体凋亡途径诱导A549细胞凋亡。