旋毛虫病McAb快速ELISA诊断盒的研制与应用

本研究建立了McAb快速诊断猪旋毛虫病的ELISA试剂盒,应用旋毛虫单克隆抗体系和层析纯化抗原(PAA)与旋毛虫肌幼虫排泄一分泌抗原(ES)作常规ELISA平行检测61头人工感染旋毛虫病猪血样,阳性率均为100％,检测健康猪血样1082头,阴性率也为100％,检测疫区自然感染猪血样1253头,阳性率分别为1.44％和1.12％,随机抽采175头猪血样和肉样作旋毛虫病消化法,常规法和快速法对比试验,诊断符合率分别为100％、97.6％和95.34％。通过对25万多头活猪检测证明,该诊断盒具有良好的灵敏性、特异性和重复性,深受广大检疫人员的欢迎。

旋毛虫病快速ELISA诊断技术

旋毛虫病快速ＥＬＩＳＡ诊断技术许威光，袁文甫，李春华，马增全，王克领，闰玉河，陈辉（河南省农科院畜牧兽医研究所）１９８７年常规间接ＥＬＩＳＡ诊断液被批准为我国兽医生物合格制剂，１９８９，１９９０年该法先后获农业部和国家科技进步二等奖，并列入我国动物检...

旋毛虫肌幼虫排泄—分泌抗原诊断猪旋毛虫病的研究与应用

应用“ES”抗原和酶复合物对猪旋毛虫病进行了ELISA的诊断研究,其抗原是对Gamble(1984)的肌幼虫培养方法经过改进研制而成的.应用这种抗原和免疫制剂建立起来的酶联免疫吸附试验诊断方法,具有灵敏度高、特异性强、操作简便、容易判断等优点,改变了我国过去应用粗制虫体抗原诊断猪旋毛虫病的状况.通过对71头人工感染旋毛虫病猪血清的诊断,可获得100%的阳性检出率.对旋毛虫病流行区120万头猪的检测证明,患猪检出率达93—95%.对250头ELISA阳性猪与宰后检查对照,其诊断符合率为98%左右.

旋毛虫肌幼虫RNA的提取及目的基因的PCR扩增

用改进的ＡＧＰＣ法成功地提取出旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ。每０．１ｍｌ压积虫体可获得１００μｇ的ＲＮＡ，其Ａ２６０与Ａ２８０及Ａ２６０与Ａ２３０的比值均接近于２，变性琼脂糖凝胶电泳显示，旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ缺少大部分真核生物所具有的２８ＳｒＲＮＡ。通过比较研究，筛选出理想的虫体处理方法。用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）直接从总ＲＮＡ中进行目的基因的扩增，得到一分子量为０．７ｋｂ的ＤＮＡ。通过限制性内切酶对其消化鉴定，证明扩增片段中的酶切位点与已知序列中的完全一致。

旋毛虫肌幼虫ES抗原的基因克隆及高效表达

作者对编码旋毛虫肌幼虫ES抗原的部分结构基因进行了克隆、鉴定和表达。用RNA PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫总RNA中反转录并扩增出0.7kb的靶DNA,酶切分析后将其克隆到融合表达载体pEX31C中。SDS—PAGE电泳表明,含重组子的大肠杆菌能够表达出一分子量为37kDa的融合蛋白(P37),后者占菌体总蛋白的22％以上,并以包含体形式存在于菌体中。经对纯化后表达蛋白的ELISA检测,证明它能被猪旋毛虫病阳性血清和抗旋毛虫单克隆抗体识别。研究结果揭示,重组蛋白P37对于研制旋毛虫病诊断抗原和免疫抗原具有潜在的应用价值。

旋毛虫ES抗原特异性蛋白两个结构基因的序列分析及重组质粒的构建

目的：获取旋毛虫ＥＳ抗原的结构基因，对其鉴定和克隆，并研制旋毛虫基因重组抗原。方法：先用反转录ＰＣＲ技术获取目的基因，经序列测定和酶切分析后，再用重组ＤＮＡ技术分别将目的基因与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及表达载体ｐＢＶ２２０连接，评价在大肠杆菌中的表达效果和鉴定表达产物的特异性。结果：获得了编码ＥＳ抗原特异性蛋白成分的两个结构基因（０．７ｋｂ和０．９５ｋｂ），其序列与文献报道的稍有差异。共构建３个重组质粒并在大肠杆菌中表达出相应分子量大小的重组蛋白，均能被猪旋毛虫病阳性血清所识别，但非融合蛋白的特异性强于融合蛋白。在相同条件下，融合蛋白的表达量高于非融合蛋白，而表达蛋白的分子量大小与表达水平呈负相关性。结论：在大肠杆菌中表达的３种重组蛋白是研制旋毛虫基因重组抗原的良好候选抗原蛋白。

检测受染旋毛虫猪血清中循环抗原对诊断和监测本病的研究

用双抗体夹心-ELISA法检测54头感染旋毛虫的猪血清,33头(61.1±6.7％)呈阳性反应。11头受染猪,于感染后不同时间检测CAg,有10头(90.9％)显示阳性,且绝大多数(8头,72.7％)于感染后3天即出现阳性反应,另于感染后6天和9天各有1头阳性。同时对比检测110头正常猪和两种其它寄生虫病猪,仅有两头(1.8％)感染弓形体的猪出现轻度交叉反应。对北京海淀区某屠宰场1987年自外地引进224头猪,进得流行病学调查,有18头(8.0±1.8％)CAg显示阳性反应,其中且有11头猪同时伴有抗体阳性;另检测陕西省商县50头猪,CAg皆为阴性。

以SPA-ELISA检测感染旋毛虫猪血清中特异性抗体

在肉品检疫中,判断屠宰猪有无旋毛虫感染,主要采用肉眼与镜检相结合的检查方法,但对早期和轻度感染者的检出率低。自70年代以来,国外用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunos-orbent assay,ELLSA)检测旋毛虫感染的报道颇多。我们曾用间接免疫过氧化物酶试验(ind-irect immunoperoxidase assay,IIP)和E-LISA试验诊断人体旋毛虫病,获得了满意的结果。在此基础上,我们亦应用SPA-ELISA诊断猪的旋毛虫感染和进行流行病学调查。 (一)

检测感染旋毛虫猪血清中循环抗原以诊断和监测本病的研究和应用

用目测快速双抗体夹心—ELISA法检测61头感染旋毛虫猪血清中CAg,40头(65.6±6.1％)呈阳性反应。100头正常猪均为阴性,30头感染囊虫和30头感染弓形体的猪,仅有1头感染弓形虫的猪出现轻度交叉反应,该猪未能追踪检查是否合并旋毛虫感染。对北京海淀区224头(1987年自外地引进),陕西商县50头和河南省新野县258头被屠杀的猪,进行流行病学调查,35头(6.6％)CAg显示阳性,其中71.4％(25/35)同时伴有抗体阳性。本法以TMBS为底物,不仅对人体无毒,而且不需新鲜配制,配好的底物溶液可以长期保存备用。本实验操作简便,完成全过程仅需20分钟,以目测观察结果,特别适于基层开展应用。实验中所需特异性抗体及酶的结合物,均系我室自制,价格低廉,相当稳定,在低温下保存2年,其效价不变,对人和动物均适用。

旋毛虫排泄-分泌抗原重组的研究

获取旋毛虫肌幼虫排泄分泌（ＥＳ）抗原的部分结构基因并进行了克隆、鉴定和表达。首先采用ＲＴＰＣＲ技术从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中获取目的基因，经酶切分析后与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及非融合表达载体ｐＢＶ２２０连接，并将其转入大肠杆菌进行表达。结果：重组质粒在大肠杆菌中表达出相应的相对分子质量的重组蛋白，经纯化后的重组蛋白可与旋毛虫病猪阳性血清发生反应。

丙硫苯咪唑混合饲料对猪旋毛虫病疗效的研究

本研究的目的是筛选丙硫苯咪唑治疗猪旋毛虫病最佳效果的剂型、剂量,用药途径和疗程.经不同剂量的混悬水乳剂、油乳剂肌肉注射和粉剂加水胃投、药物混入饲料饲喂等途径给药,共治疗人工感染猪旋毛虫病患猪62头.结果以丙硫苯咪唑300ppm混合饲料饲喂10天的效果最佳,杀虫率为100%.肌幼虫被药物杀死后,在一段时间内呈现死亡肌幼虫包囊,虫体钙化,钙化虫体崩解吸收由增生的结缔组织代替——机化.最后由肌纤维再生修复受损伤的肌组织,整个过程半年左右.

旋毛虫单克隆抗体特性鉴定

用已建立的抗旋毛虫单克隆抗体杂交瘤细胞株(D_4,E_2)所分泌的单克隆抗体(McAb),经纯化后电泳分析,其重链分子量为55KD,轻链分子量为29KD,符合IgG抗体特点。两株单克隆抗体与旋毛虫阳性猪血清所针对的旋毛虫抗原决定簇相同,都不与猪的其它寄生虫发生交叉反应,与抗原的相对亲和力E_2>D_4,单克隆抗体亲和层析纯化抗原的分子量为49KD,经免疫斑点染色证明为糖蛋白。

猪旋毛虫与常见寄生虫交叉反应试验报告

用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法对猪旋毛虫等常见寄生虫的交叉反应试验结果表明,猪旋毛虫与猪的肺丝虫、蛔虫、囊虫及细颈囊尾蚴均无交叉反应。

旋毛虫肌幼虫ES重组抗原的纯化

旋毛虫肌幼虫ＥＳ重组抗原的纯化陈辉，闫玉河，许威光，马增全，李春华（河南省农科院畜牧兽医研究所郑州４５０００２）旋毛虫病的免疫学检测抗原，主要是用体外培养的旋毛虫肌幼虫的排泄－分泌抗原（ＥＳ），但由于ＥＳ抗原的制备程序繁琐，生长周期长，因而，抗原的应...

血清中病毒DNA三种提取方法比较

血清中病毒ＤＮＡ三种提取方法比较陈辉，闫玉河，许威光，马增全，李春华（河南省农科院畜牧兽医研究所，郑州４５０００２）随着分子生物学的发展，ＤＮＡ操作技术越来越多地被用于诊断畜禽疾病，已成为血清学指标有效的补充及替代方法。但进行核酸操作的前提，是需有效...

病鸡血清中鸡传染性贫血病病毒DNA的PCR扩增及抗体的ELISA检测

根据鸡传染性贫血病病毒（ＣＡＶ）的基因结构，设计并合成一对限制扩增长度为０．６８ｋｂ的ＰＣＲ引物．直接对临床可疑病鸡的血清进行靶ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增．在不同地区的３批样品中，有２批扩增出一二分子量接近０．７ｋｂ的单一特异性ＤＮＡ片段．用限制酶ＢｇｌⅡ消化ＰＣＲ产物．可获得分子量分别为０．３３ｋｂ和０．３５ｋｂ两个ＤＮＡ片段，其酶切位点与靶ＤＮＡ的相吻合．将ＰＣＲ扩增为阳性的病料接种６日龄ＳＰＦ鸡胚，并取其１８日龄胚肝和由接种鸡肛孵出的雏鸡的血清重新进行ＰＣＲ扩增，结果均为阳性，而同期对照胚肝及雏鸡血清为阴性．此外还用胚胎时接种过病料的雏鸡肝、脾和胸腺等组织抽提液作抗原，建立了检测ＣＡＶ血清抗体的ＥＬＩＳＡ方法．研究结果提示，用ＰＣＲ直接对病鸡血清中ＣＡＶＤＮＡ的扩增以及ＣＡＶ抗体的ＥＬＩＳＡ检测是快速和特异的．它为鸡传染性贫血病（ＣＩＡ）的流行病学调查、实验室诊断、ＣＡＶ毒株的分离和鉴定提供了必要的检测手段．

旋毛虫单克隆抗体特性鉴定

将两株抗旋毛虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞（Ｄ４，Ｅ２）所分泌的ＭｃＡｂ，经纯化后电泳分析，其重链分子质量为５５ｋｕ，轻链分子质量为２９ｋｕ，符合ＩｇＧ抗体的特点。两株ＭｃＡｂ与旋毛虫阳性猪血清所针对的旋毛虫抗原决定簇相同，都不与猪的其它寄生虫发生交叉反应，与抗原的相对亲和力Ｅ２＞Ｄ４，ＭｃＡｂ亲和层析纯化抗原的分子质量为４９ｋｕ，经免疫斑点染色证明为糖蛋白。

旋毛虫基因重组抗原对小鼠的免疫保护试验

分别用5μg和15μg的旋毛虫基因重组抗原对小鼠进行腹腔注射免疫,结果于免疫后第4周小鼠体内的抗体效价明显上升,至第7周达到高峰。当每只鼠用90条旋毛虫肌幼虫口服攻击后,抗体效价稍有下降,但到攻虫后的第5周基本回升至攻击前水平。通过人工消化法集虫和计算每克肌肉含虫数(LPG),发现注射5μg抗原蛋白的小鼠,其 LPG比对照鼠的平均减少 7.7％;而注射15μg抗原蛋白的小鼠的 LPG比对照鼠的减少33.5％。试验表明,旋毛虫基因重组抗原对小鼠有一定的免疫保护作用。

浅谈控制猪旋毛虫病传播的对策

旋毛虫病是由旋毛虫引起的一种人、畜共患的寄生虫病。猪感染旋毛虫后,一星期左右出现食欲不振,呕吐、腹泻、腹痛,半月后幼虫进入肌肉内,出现肌肉痛疼,运动失调,吃食困难。重度感染者导致伤亡。人对旋毛虫抵抗力低,感染后多在两周内发痛,出现恶心呕吐,腹痛、腹泻,厌食、乏力,体温升高至38～40℃,呈弛张热。猪旋毛虫病一旦在猪群内流行,将影响养猪业的发展,危害人的身体健康。