BCR/ABL融合蛋白对鞘氨醇激酶和1-磷酸鞘氨醇分泌的影响

目的研究高表达BCR/ABL融合蛋白对人鞘氨醇激酶(SPK)表达、活性及1-磷酸鞘氨醇(S1P)分泌的影响。方法使用pLXSN和pLXSN-bcr/abl的重组逆转录病毒感染HL-60和ECV304细胞并筛选出pLXSN和pLXSN-bcr/abl的细胞。利用RT-PCR鉴定病毒转染。WesternBlot检测SPK表达,γ-32P-ATP掺入法检测细胞SPK活性和培养上清的S1P含量。应用同样方法检测不同剂量Gleevec对K562细胞培养上清中S1P的影响。结果RT-PCR结果显示bcr/abl基因转染成功。高表达BCR/ABL融合蛋白的HL-60和ECV304均比转染空载体后的细胞SPK表达、活性和S1P分泌均显著提高。随着Gleevec浓度的增加,K562细胞培养上清中S1P的含量逐渐减少。结论BCR/ABL融合蛋白可提高细胞SPK表达、活性和S1P分泌。

腺病毒介导HGF基因逆转肝纤维化的实验研究

目的评价腺病毒介导肝细胞生长因子(HGF)对肝纤维化的治疗作用。方法 30只雄性Wistar大鼠皮下注射四氯化碳(CCl4)8周,诱导肝纤维化产生。大鼠随机均分为5组,分别注射不同剂量的Ad-HGF或病毒。A组注入PBS,B组注入5×109PFU病毒;C组注入1×109PFU Ad-HGF,D组注入2.5×109PFU Ad-HGF;E组注入5×109PFU AdHGF。定时采大鼠血清样品,以动态监测大鼠肝功能。8周后处死大鼠,并采血和检测肝组织。采用ELISA法测定在体外和体内的HGF表达;并测定血清中腔脯氨酸(Hyp)含量;病理分析肝脏组织变化及转化生长因子-β1(TGF-β1)表达和胶原蛋白沉积。结果在细胞培养液中HGF分泌增加约44倍,达到8.8 ng/ml。在注射Ad-HGF大鼠组内,血浆HGF的浓度增加约5倍,超过50 ng/ml,并持续至少10 d。在基因治疗后谷丙转氨酶(GOT)、谷草转氨酶(GPT)、血清中总蛋白,白蛋白,总胆红素明显恢复(P<0.05)。离体肝组织显示,D及E组肝脏形态有明显恢复。在注射CCl48周后,肝组织Hyp含量明显增加,D及E组Hyp含量低于B组及C组。病理研究提示Ad-HGF同样也减弱了转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达和胶原蛋白的沉积。结论静脉注射AdHGF可促进肝功能的恢复和提高胶原溶解能力,有利于缓解肝脏纤维化。

表达单纯疱疹病毒胸苷激酶的溶瘤腺病毒靶向癌症治疗:在体外评估

目的我们希望评估与单纯疱疹病毒胸苷激酶相结合的溶瘤腺病毒治疗效果是否更好。方法我们构建了一种新型的溶瘤腺病毒Ad-ETK,它包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,E1A基因的编码序列,内部核糖体进入位点序列(IRES)和疱疹单纯病毒胸苷激酶(HSV-TK)编码序列。腺病毒Ad-ETK感染了各种肿瘤细胞,并通过用RT-PCR表明的E1A和HSV-TK基因的表达。同时测定了病毒的溶瘤能力及其与HSV-TK系统协同效果。并采用流式细胞仪测量病毒感染效率。结果溶瘤腺病毒Ad-ETK表达了E1A和HSV-TK基因,并且选择性的hTERT-阳性的肿瘤细胞中复制,复制的子代病毒可达150 IU/cell。在体外研究表明,Ad-ETK加更昔洛韦(GCV)有明显的导致细胞死亡的效果。结论溶瘤腺病毒加HSV-TK/GCV自杀基因显著改善治疗效果,在活体评估的结果预示的溶瘤病毒有很好的开发前景。

敲低和敲除OPTN基因SKOV3细胞的构建及其对抗癌药物敏感性的影响

目的利用RNA干扰技术建立稳定敲低OPTN蛋白的人SKOV3细胞株和利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立稳定敲除OPTN蛋白的人SKOV3细胞株,并研究降低OPTN基因表达对细胞抗癌药物敏感性的影响。方法针对OPTN基因设计shRNA和sgRNA的序列,并与慢病毒载体质粒pGPU 6_GFP_Neo和敲除质粒PX 459载体连接产生重组载体。并将重组的质粒测序验证,将测序成功的重组质粒载体与包装质粒(psPAX 2、pMD 2.G)共转染293 T细胞进行病毒包装,收集病毒上清液并感染SKOV3细胞,获得稳定敲低和稳定敲除OPTN基因的SKOV3细胞株。RT-PCR检测敲低组OPTN基因的表达的变化,PCR检测敲除组的基因组DNA的变化,Western blot法分析检测OPTN蛋白的表达情况。MTT法检测DDP对卵巢癌细胞增殖的影响,qRT-PCR检测caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA的表达情况,Western blot检测caspase3、Bax、和Bcl-2蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒载体和基因敲除载体,在SKOV3细胞中的OPTN蛋白表达降低(敲减细胞株)或完全敲除(敲除细胞株)。OPTN基因被敲减和敲除的卵巢癌细胞(SKOV3)对顺铂(DDP)的敏感性降低;与对照组相比,DDP对细胞抑制率降低(P<0.05,P<0.01),基因敲除的细胞效果更好。通过qRT-PCR和Western blot检测稳定敲减和敲除OPTN蛋白的SKOV3细胞其凋亡相关基因caspase3、Bax的mRNA和蛋白的表达量降低,而Bcl-2的表达量上升(P<0.05,P<0.01)。结论在卵巢癌中降低或去除OPTN基因表达,能够降低卵巢癌细胞对抗癌药物DDP的敏感性,OPTN可能通过影响凋亡相关途径实现的。

乳源六肽预防和降低小鼠急性酒精性肝损伤及其机制

目的研究乳源六肽(PGPIPN)在降低小鼠酒精性肝损伤方面的作用及其机制。方法建立小鼠急性酒精肝损伤的动物模型,健康雄性昆明种小鼠60只,体质量18~22 g,动物预饲养1周后分成6组:对照组、模型组、PGPIPN L组、PGPIPN M组、PGPIPN H组和谷胱甘肽(GSH)组,每组10只小鼠。为了制作小鼠急性酒精性肝损伤的动物模型,实验最后3 d,PGPIPN低、中、高剂量组、GSH组和模型对照组以56°红星二锅头酒灌胃,对照组使用等量蒸馏水灌胃,建立小鼠的急性酒精性肝损伤的对照模型。12 h后,将小鼠颈椎脱臼处死,取材检测相关指标。在实验结束时,将小鼠称重并麻醉,收集血清和肝脏样品,取肝脏称重后保存,计算出肝脏指数。同时,测定小鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)含量,血清和肝匀浆中三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)的含量。取肝脏组织制作成病理切片,观察肝脏细胞的病理学变化。原代细胞培养,流式细胞术检测肝脏组织的凋亡状况。结果生化分析显示模型组小鼠血清TG、TC和肝脏TG(肝匀浆中TG的浓度)高于对照组,PGPIPN H剂量组、PGPIPN M剂量组和PGPIPN L剂量组血清中ALT、AST含量与模型组相比降低,PGPIPN高剂量组中TNF-α含量较模型组也有减少。对照组中,肝细胞结构完整,凋亡指数为3.61%。而模型组中肝索结构紊乱,液泡数目增加,肝脏细胞的边界不清晰,细胞核消失,细胞皱缩,凋亡指数为36.87%,出现了明显的细胞凋亡状态。PGPIPN L组细胞出现凋亡状态,而PGPIPN H组细胞状态良好,无凋亡现象发生。流式细胞术检测细胞凋亡,对照组为4.558%,模型组为31.50%。结论PGPIPN能够预防和降低小鼠急性酒精性肝损伤。

过表达OPTN和TAU-P301-L基因腺相关病毒构建与鉴定

目的获得能够过表达OPTN和TAU-P301-L基因的重组腺相关病毒,检测其在体外对293T细胞的感染,并且为阿尔茨海默氏病(AD)研究提供新思路。方法从含有目的基因的大肠杆菌中提取包涵目的基因的质粒,利用PCR扩增获得目的基因,目的基因OPTN构建到pAAV-IRES-ZsGreen1载体,目的基因TAU-P301L-V5构建到pAAV-CMV-mkate-IRES载体。鉴定质粒阳性克隆并测序。重组质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5分别与包装质粒pAAV-RC9、辅助质粒pHelper通过Lipofiter^(TM)2000共转染293T细胞,获得AAV9病毒。利用相同方法,不使用目的基因构建对应绿色和红色AAV9对照病毒。qPCR法测定重组腺相关病毒载体滴度,病毒载体感染293T细胞进行病毒有效性及安全性鉴定,Western blotting和RT-PCR进行蛋白表达的鉴定,MTT检测OPTN蛋白与TAU-P301-L蛋白对293T细胞活力的影响。结果测序结果显示成功构建pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相关病毒载体,qPCR测得病毒滴度为1.0×10^(12) vg/ml,病毒载体感染293T细胞转染效率为33.6%和20.5%, Western blot和RT-PCR显示蛋白过量表达。MTT结果显示OPTN组挽救了TAU-P301-L组的细胞凋亡。结论成功构建过表达OPTN和TAU-P301-L基因的腺相关病毒。OPTN蛋白可以减弱TAU-P301-L蛋白的细胞毒性。

土大黄苷对乳腺癌细胞SK-BR-3增殖的影响

目的观察土大黄苷对乳腺癌细胞SK-BR-3增殖的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用MTT法检测土大黄苷对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用,倒置显微镜下观察细胞的形态学变化,W estern印迹检测Akt及p-Akt蛋白的表达情况。结果土大黄苷可抑制SK-BR-3细胞增殖,其作用具有浓度和时间依赖性,72 h的IC50为(181.3±11.4)μmol/L。200、400μmol/L土大黄苷作用48 h后显示出明显的细胞毒作用,显微镜下可见细胞碎片增多、细胞密度减小。土大黄苷在100、200、400μmol/L浓度时均可抑制p-Akt蛋白的表达。结论土大黄苷可抑制SK-BR-3细胞的增殖,其机制可能与抑制p-Akt表达有关。

致死性家族失眠症脑组织基因表达谱特点分析

目的研究致死性家族失眠症(FFI)脑组织基因表达谱特点。方法取3例FFI患者丘脑组织按照标准流程制备生物素标记的互补RNA,以正常人丘脑RNA为对照,利用人类基因组芯片U133+2.0检测FFI患者丘脑中差异表达基因,并分析差异基因表达特点。结果共有1 314个差异表达基因,其中254个上调,1 060个下调。主要受影响的分子功能是转录、转录调节和电子转移链。改变最显著的信号通路是阿尔茨海默病、帕金森病和氧化磷酸化。结论 FFI改变了丘脑大量基因表达,其中受影响最显著的信号通路与其他神经退行性疾病相关。

结合基因组分析预测炎症相关miRNA及其靶标

目的:预测炎症相关miRNA及其靶基因。方法:将基因组分析结果和miRNA靶标预测结果融合。结果:通过两种方法所产生数据的叠加,可以挑选出候选的关键miRNA和关键靶基因作为进一步实验研究的线索。结论:将基因组分析与靶标预测相结合可以有效减少假阳性预测结果,缩小实验验证的范围。

自噬与病毒复制

自噬是真核生物中一类保守的胁迫机制，是溶酶体蛋白降解途径的主要形式之一。自噬通过降解衰老损伤的细胞器和老龄蛋白维持细胞内稳态（homeostasis），同时通过吞噬细胞内微生物病原体行使天然免疫功能。在不同病毒感染过程中，自噬也可以发挥不同的作用：既能阻止病毒复制也可以促进病毒复制。当自噬发挥抗病毒作用时，通过包裹病毒蛋白或病毒颗粒运至溶酶体，进行降解，这一过程称作异自噬（xenophagy）。相反，一些病毒蛋白与宿主自噬蛋白相互作用，阻滞自噬过程，促进病毒复制。另外，还有～些病毒利用自噬机制完成自身复制并行非裂解细胞型释放。

膜蛋白Flotillin-1与细胞膜PrPC内吞相关性研究

目的研究膜蛋白Flotillin-1是否与PrP。蛋白内吞相关。方法利用免疫印迹法观察不同细胞株中Flotillin-1表达情况；利用免疫共沉淀的方法，检测Flotillin-1和PrPc蛋白在Cu2＋存在条件下相互作用的情况。结果①免疫印迹法显示Flotillin-1在多种细胞株中均有表达，且表达量没有明显差别；②免疫共沉淀实验（IP）结果提示在cu2＋处理条件下细胞中有PrPc与Flotillin-1蛋白复合体的形成，并且与cu2＋浓度以及cu2＋处理时间相关；结论膜蛋白Flotillin-1与细胞膜PrPc内吞过程存在相关性。

羊瘙痒因子139A感染的小鼠脑组织中AMPK—ULKl自噬调节通路的研究

目的研究感染羊瘙痒因子139A的小鼠脑组织中自噬的活化及其机制。方法采用WesternBlot方法检测感染羊瘙痒因子139A的小鼠终末期脑组织匀浆中的AMPK、ULKl及其磷酸化水平和LC3II的表达，并对其进行定量分析。结果感染139A毒株的小鼠脑组织终末期脑组织中AMPK、ULKl及其磷酸化水平均表达升高。同时发现LC3II水平增加。结论AMPK-ULKl通路在139A感染的小鼠脑组织中活化并且有可能对自噬的激活起到了重要的作用。