深化基因工程课程改革 提高教学质量

基因工程是生物工程专业的主干课程,必须以培养学生创新精神和实践能力为核心,重点培养学生综合素质和能力。为此,我们构建了理论和实践教学体系,优化课程教学内容,加强实践教学环节,充分运用现代化多媒体教学手段,加强网络课程建设,改进教学方法等为内容的教学改革。既注重传授学生专业知识,更注重传授学会"学习"的方法,旨在提高基因工程课堂教学质量,从而满足生物工程专业和21世纪人才培养要求。

大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１，回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因，再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％，而且无天然ＳＴ１生物毒性。

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的克隆与核苷酸序列分析

将含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒ｐＫＭＡ１００用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收０．９５ｋｂα毒素基因片段，再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，然后将处理好的ｐＥＴ－２８ｂ（＋）与０．９５ｋｂ的α毒素基因片段通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶进行粘性末端连接，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＡ１含有产气荚膜梭菌α毒素基因。确定了α毒素基因的全部核苷酸序列，并证明其具有正确的阅读框架。

大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合基因的构建

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１，与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接，转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒，得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。

产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因在大肠杆菌中的高效表达

对含有产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）α毒素基因的重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１），通过培养性状观察和小鼠接种试验，证明这２株重组菌株均无致病性。随后对这２株重组菌株的表达产物进行了研究，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层凝胶扫描分析，ＩＰＴＧ诱导３～４ｈ后的ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白３３．２１％，ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ｐＸＥＴＡ１）表达的α毒素占菌体总蛋白２７．２５％，其相对分子质量约３７５００；经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，表达产物可被α毒素抗血清识别。包涵体粗提物的免疫攻毒试验结果表明，以１倍致死量攻击的免疫小鼠可获得１００％（３６／３６）的保护，以２倍致死量攻击的免疫小鼠可获得９４．２８％（３３／３５）的保护，从而说明表达产物具有良好的免疫原性。

C型产气荚膜梭菌α、β_1毒素基因的融合

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出α和β1 毒素基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含αβ1 融合基因表达质粒重组菌株BL2 1 (DE3) (pETXAB1 )。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1含有αβ1 融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的αβ1 融合蛋白能够被α、β1 毒素抗体识别。免疫实验结果表明,αβ1 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9 44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。

C型产气荚膜梭菌β_1、β_2毒素基因的融合

利用PCR技术 ,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出 β1 和 β2 毒素基因 ,构建了含 β1 - β2 融合基因表达质粒的重组菌株BL2 1(DE3) (pETXB1_2 )。经酶切鉴定和序列测定证实 ,构建的重组质粒pETXB1_2含有 β1 - β2 融合基因 ,且基因序列和阅读框架正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的 β1 - β2 融合蛋白能够被 β1 、β2 毒素抗体识别。免疫实验结果表明 ,用β1 - β2 融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗 1MLD的C型产气荚膜梭菌C5 9_4 4毒素攻击 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株。

C型产气荚膜梭菌α、β_1、β_2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXA1中扩增出0.95 kbα毒素基因,将其连接到经NcoⅠ单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kbβ1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kbα-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol?L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.

大肠杆菌肠毒素ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１ＬＴＢ融合蛋白的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原，免疫小鼠，结果免疫小鼠至少能抵抗１５ＭＬＤ的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ，ＳＴ＋，ＬＴ＋）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后，采集的血清能够中和天然ＳＴ１的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。

C型产气荚膜梭菌β毒素基因克隆与核苷酸序列分析

用ＰＣＲ技术，从含Ｃ型产气荚膜梭菌β毒素基因质粒ｐＢ１２中扩增出了０．９５Ｋｂ的β毒素基因，然后用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对其进行双酶切处理，最后将其定向连接在事先经同样内切酶处理的载体ｐＥＴ－２８ｃ（＋）中的相应位点上，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＢ２含有产气荚膜梭菌β毒素基因，确定了其全部的核苷酸序列。

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ基因核苷酸序列分析与免疫原性研究

对构建的重组质粒ｐＸＳＴ１（含有耐热性肠毒素ＳＴ１和ＬａｃＺ基因）进行核苷酸序列分析的结果表明，该质粒中含有２个正向串联在一起的ＳＴ１基因，且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。免疫学试验结果表明，构建的ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）重组菌株安全无毒。该重组菌株表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，且抗体能中和天然肠毒素ＳＴ１活性，具有较好的免疫保护作用。由此表明。

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体的基因克隆及核苷酸序列分析

应用 RT-PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 ( Mc Ab)的杂交瘤细胞 2 E3中 ,扩增出抗体 VH 和 VL 基因 ,用 linker( Gly4Ser) 3基因 ,将 VH 和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆至 p GEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 6bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH 和VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 ( B)和轻链κ

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术 ,从大肠杆菌C8390 2质粒中扩增出K88ac基因、ST1 突变基因和LTB 基因 ,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化 ,构建了含K88ac ST1 LTB 融合基因表达载体的重组菌株BL2 1(DE3) (pXKST3LT5 )。经酶切鉴定和DNA序列分析证实 ,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac ST1 LTB 融合基因 ,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测 ,重组菌株表达的K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够被ST1 单抗、LTB 和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实 ,表达的融合蛋白已丧失天然ST1 肠毒素的活性。免疫实验结果表明 ,K88ac ST1 LTB 融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体 ,该抗体具有中和天然ST1 肠毒素的毒性作用 ,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄。

大肠杆菌不耐热性肠毒素LT_B基因的克隆及其核苷酸序列分析

用内切酶ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切大肠杆菌质粒ｐＥＷＤ２９９，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，最后将ｐＵＣ１８ＤＮＡ与５０５ｂｐ的ＬＴＢＤＮＡ进行连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＳａｃⅠ／ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１。再将ｐＸＬＴ１进行ＥｃｏＲⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠＫｌｅｎｏｗ大片段补平、ＨｉｎｄⅢ酶切处理，然后与用ＨｉｃⅡ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＵＣ１８连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＸｂａⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１－１。将质粒ｐＸＬＴ１－１进行核苷酸序列分析。

产气荚膜梭菌α-β融合基因的高效表达

用PCR从含产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒pXETA1中扩增出α毒素基因 ,用NcoI和BamHI双酶切该α毒素基因 ,回收 0 .95kb的α毒素基因片段 ,再用NcoI和BamHI双酶切含产气荚膜梭菌 β毒素基因质粒pXCPAB2 ,与上述回收的α毒素基因片段连接 ,转化至受体菌BL2 1(DE3)中。经NcoI、BamHI、NcoI酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实 ,获得了理想重组质粒pXCPAB2 ,该重组质粒含有α β融合基因。重组菌株BL2 1(DE3) (pXCPAB2 )经IPTG诱导后 ,其表达产物经ELISA检测和SDS_PAGE分析 ,结果表明重组菌株可以高效表达α β融合蛋白 ,该融合蛋白占菌体总蛋白的 2 2 .14%。

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1.2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI/EcoRI和BamHI/EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPA1中含有α毒素全基因。随后用NcoI/EcoRI酶切质粒pXCPA1,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXA1,经NcoI/EcoRI和BamHI/EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXA1)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的16.28%。

表达大肠杆菌K88ac-ST_1-LT_B融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达大肠杆菌K88ac_ST1_LTB 融合蛋白的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原 ,免疫小鼠 ,结果免疫小鼠至少能抵抗 2MLD的大肠杆菌强毒株C83 90 2 (K88ac,ST+ ,LT+ )的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后 ,采集的血清能够中和天然ST1的毒性。这表明构建的工程菌株BL2 1 (DE3 ) (pXKST3LT5 )可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。