生物化学与分子生物学实验教学的体会

生物化学与分子生物学实验是生物化学课程教学的重要组成部分,是培养学生掌握基本实验技能,把所学的生化理论知识和实验内容相结合的重要手段,有助于提高学生动手实践的能力、分析解决问题的能力以及创新综合的能力。现根据几年的实验教学实践,总结了几点体会,就如何提高实验课的教学质量进行了一定的分析和探讨。

提高生物化学合班教学质量的探讨

合班教学是为了缓解教学资源紧张的有效方法,但合班教学是把"双刃剑",在实施中存在着不少的现实问题,故有必要对此找到相应的应对策略,以提高教学质量。该文从教学实践中探讨合班教学在生物化学教学中的应用。

人类乳头瘤病毒18 E7原癌蛋白对宫颈癌细胞系中组蛋白去乙酰化酶1表达的下调作用

目的研究宫颈癌中人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase1,HDAC1)表达之间的关系。方法运用RT-PCR和Western blot方法检测3株宫颈癌细胞中HDAC1表达水平。经脂质体2000介导将含有HPV18 E7基因的重组表达质粒瞬时转染人宫颈癌C-33A细胞,运用RT-PCR和Westernblot方法检测转染后C-33A细胞中HDAC1的RNA和蛋白水平改变。结果HDAC1在C-33A细胞中表达最高,CaSki细胞中次之,HeLa细胞中最少。C-33A细胞在转染HPV18 E7基因后HDAC1表达降低。结论HDAC1表达高低可能与HPV是否感染及感染亚型有关,HPV18 E7可能直接或间接下调细胞中HDAC1表达。

GW3965在Raji细胞中对BLyS表达的影响

目的探讨肝X受体(liver X receptors,LXRs)的特异性激动剂GW3965在Raji细胞中对B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)表达的影响。方法 MTT法检测不同浓度的GW3965(浓度分别为0.5、5、10μmol/L)对Raji细胞活性的影响,观察时间为加入GW3965共孵育后24 h。用LXR的特异性激动剂GW3965刺激人B细胞淋巴瘤株Raji细胞,经RT-PCR检测LXR特异性靶基因三磷酸腺苷结合盒A1(ATP-binding cassette,ABCA1)mRNA的表达;经RT-PCR和Western blot检测BLyS的表达。结果对照组1‰DMSO D(492)为(0.632±0.055),0.5、5μmol/L和10μmol/L的GW3965 D(492)为(0.609±0.073)、(0.612±0.052)和(0.628±0.055)。LXR的特异性配体GW3965对细胞活性无影响(P>0.05)。GW3965作用于Raji细胞后,ABCA1 mRNA表达剂量依赖性上调,LXR活化后可在转录和翻译水平剂量依赖性下调抑制BLyS的表达。结论 LXR在Raji细胞中可抑制BLyS的表达。

白藜芦醇上调BATF2表达及抑制肝癌细胞增殖的研究

目的初步探讨白藜芦醇对BATF2表达的调控作用及对肝癌细胞(HepG2)增殖能力的影响。方法用不同剂量的白藜芦醇(终浓度分别为20、40、80μmol/L)处理HepG2细胞,进行逆转录PCR(RT-PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)、Western blot检测碱性亮氨酸拉链转录因子2(BATF2)mRNA和蛋白水平表达的变化,并采用细胞增殖检测试剂(CCK-8)实验检测对细胞增殖能力的影响。结果在HepG2细胞中,白藜芦醇能剂量依赖性地诱导BATF2在转录和翻译水平的表达,并抑制细胞的增殖(P<0.05);基因检测发现白藜芦醇显著诱导BATF2启动区活性,-244^-152区域存在白藜芦醇的可能结合位点。结论白藜芦醇能增强HepG2细胞中BATF2的表达并抑制细胞的增殖,提示上调BATF2的表达可能是白藜芦醇抑制肝癌细胞增殖的机制之一。

MiR-7下调LXRβ表达而抑制HepG2细胞脂质生成的作用

目的初步探讨miR-7对LXRβ的抑制作用及其在肝细胞脂质生成中的作用。方法生物信息学分析,预测LXRβmRNA的3'-UTR上miR-7的可能结合位点。在人肝细胞系Hep G2中转染miR-7,以Real-time PCR、Western blot检测LXRβmRNA水平和蛋白水平表达的变化;构建LXRβ3'-UTR报告基因质粒p MIR/LXRβ,Report assay检测报告基因荧光素酶活性;Real-time PCR检测miR-7对LXRβ激动剂诱导的脂质生成相关靶基因FAS、ACC的表达变化。结果在人肝细胞中,miR-7能够显著抑制LXRβ的表达(P<0.05),且miR-7能降低LXRβ重组质粒p MIR/LXRβ的荧光素酶活性(P<0.05)。同时抑制其激动剂对脂质代谢相关靶基因的诱导作用。结论 miR-7可通过结合在LXRβ3'-UTR区域而抑制其表达,进而抑制FAS、ACC的表达而抑制脂质生成。

Androsterone在血管内皮细胞Eahy926中对SR-BI表达的影响

目的研究法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)对B类清道夫受体Ⅰ(scavenger receptor class BtypeI,SR-BI)表达的调控。方法FXR配体androsterone不同浓度处理Eahy926细胞,RT-PCR检测FXR特异靶基因小异源二聚体伴侣受体(small heterodimer partner,SHP)表达量的变化。RT-PCR和Real-timePCR分析经androsterone处理后Eahy926细胞中SR-BImRNA表达的变化。用Western blot检测SR-BI蛋白表达的变化。结果经androsterone刺激,Eahy926细胞中SHP的表达明显升高,表明FXR被活化。在经androsterone刺激的血管内皮细胞中,SR-BI在转录水平和翻译水平,表达均显著上升。结论FXR可在血管内皮细胞系Eahy926中上调SR-BI的表达水平。

法尼醇X受体对HepG2细胞蛋白C表达的影响及机制的初步研究

目的观察法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)的天然激动剂鹅脱氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)对HepG2细胞蛋白C(protein C,PC)表达的影响,探讨其引起变化的可能机制。方法以不同浓度(25、50、75μmol/L)FXR激动剂CDCA刺激HepG2细胞,RT-PCR分别检测各组细胞FXR特异性靶基因小异源二聚体伴侣分子(small heterodimer partner,SHP)及PCmRNA表达变化,并用实时荧光定量PCR(real-time PCR)分析各组PC的表达量;ELISA检测各组细胞培养上清液中PC蛋白分泌量的变化;瞬时转染结合报告基因检测在人胚肝L02细胞中转入组成性活化的FXR表达质粒(VP-FXR),观察PC启动子活性的改变。结果经FXR配体CDCA刺激的HepG2细胞,随着CDCA浓度的增高,SHP、PC mRNA的表达逐渐增高,细胞培养上清液中PC蛋白表达也逐渐升高,呈剂量依赖性;在人胚肝L02细胞中,活化的FXR可增强PC启动子的活性约2.9倍。结论 CDCA活化FXR引起HepG2细胞中PC mRNA和蛋白表达的升高,其调控机制与PC启动子的活化相关。

基于人HMGB1-B box的抑制性小肽筛选及其抗炎功能分析

目的从噬菌体构象型7肽库中筛选人HMGB1-Bbox的抑制性小肽。方法以重组人HMGB1-Bbox为靶分子对噬菌体构象型7肽库进行6轮亲和筛选，获得Bbox结合的克隆，并经ELISA验证。选取亲和力高的克隆进行DNA测序，并推导出呈现的多肽序列，通过IL-6 ELISA检测噬菌体呈现的小肽对人HMGB1-B box致炎功能的抑制作用。结果经过6轮亲和筛选，噬菌体的回收率增加，阳性克隆得到富集。挑选15个结合力强的克隆进行测序，推导出2个多肽序列。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制人HMGB1-B box刺激THP-1细胞产生炎症因子的能力。结论获得了噬菌体呈现的能够抑制人HMGB1-B box的两个小肽。

菊苣酸在HepG2细胞中对SOSC3表达的调节作用

探讨菊苣酸(Chicoric acid,CRA)在人肝细胞系HepG2细胞中对细胞因子信号转导抑制分子3(Suppressor of cyto-kine signaling 3,SOCS3)表达的影响,用剂量为0、5和50μg.mL-1 CRA分别处理HepG2细胞24h后,经RT-PCR、Real-time PCR检测SOCS3基因的mRNA表达情况,再以上述不同剂量CRA分别处理细胞24h以及50μg.mL-1CRA分别处理HepG2细胞0、6、12、18和24h后,用Western blot法检测SOCS3基因的表达情况。研究结果显示CRA作用于HepG2细胞后,SOCS3基因的mRNA和蛋白表达水平随着CRA剂量增加而显著下降(p<0.01),且呈现一定的剂量依赖性;随着处理时间的增加,SOCS3蛋白表达水平下降更加明显,说明在翻译水平CRA不仅呈剂量依赖性,还呈时间依赖性下调SOCS3蛋白的表达。这些结果提示CRA可抑制SOCS3蛋白在HepG2细胞中的表达。

生物化学与分子生物学实验教学改革初探

为进一步提高生物化学与分子生物学实验课的教学质量,增强学生应用理论知识的能力和综合素质;针对目前实验教学存在的不足,在生物化学与分子生物学实验教学中,丰富教学内容(如更新内容、区分设置实验、增补设计性/综合性实验)、改革教学方式(增加教学手段、教学方法及示教环节)和完善教学评价(兼顾实验报告考核和操作考核)等方面进行了初步探索。通过调查问卷分析,发现学生对实验课学习热情更高,实验技术更熟练,实验教学效果明显提升。现将近年在这些方面实施改革的方法及效果进行小结,以期为医学院校生物化学与分子生物学实验教学提供有益借鉴。