同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法。研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测。

黄芪多糖微胶囊制备及对刺参抗病力的影响

以黄芪多糖为芯材,海藻酸钠为壁材,采用苯酚-硫酸比色法,测得微胶囊的载药量为108mg/g;包埋率为85.7%。以初始体重为30.00±1.00g的刺参为研究对象,在室内循环水系统中进行连续35d的饲喂实验;以基础饲料为对照组,在基础饲料中分别添加3%空白微胶囊和1%、3%和5%黄芪多糖微胶囊(实验组1～4);饲喂实验结束后,通过注射刺参腐皮综合征致病菌灿烂弧菌Vibrio splendidus进行刺参攻毒实验。攻毒后14d内,实验组3和实验组4的累计发病率分别为13.33%和12.22%,均显著低于对照组、实验组1和实验组2(分别为40.00%、37.78%和32.22%)(P<0.05);实验组3和实验组4的累计发病率差异不显著(P>0.05);而实验组2累计发病率也显著低于对照组(P<0.05),但是对照组与实验组1、实验组1与实验组2之间累计发病率差异均不显著(P>0.05)。由此可知,添加3%和5%黄芪多糖微胶囊可以提高刺参的非特异性免疫力和抗病力,对刺参的免疫保护率可分别达到66.67%和69.44%。

病原检测基因芯片应用及在水产病害检测的前景

基因芯片技术是近年来迅速发展起来的一项新技术,已成为国内外研究的热点。作为生物芯片技术发展中最完备的一个分支,基因芯片以其高通量、高灵敏性、高特异性的特点,在细菌、病毒、真菌等病原检测和鉴定方面发挥着越来越重要的作用。本文介绍了基因芯片的原理和作为检测手段的优越性,并综述了基因芯片技术在细菌和病毒检测方面的应用,分析了现有水产动物病原检测技术,提出了在现有水产动物病原生物信息学的基础上,研发水产养殖动物病害诊断基因芯片的策略。

寄生养殖大菱鲆的海洋盾纤类纤毛虫(弗州拟尾丝虫相似种)的形态学和18S rDNA序列分析

从养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)患病鱼体中分离出一种寄生纤毛虫,通过活体观察、碳酸银法染色对其形态学特征进行分析,初步鉴定为弗州拟尾丝虫相似种(Parauronema cf.virginianumThompson,1967)。同时对其18S rDNA序列进行了测定和分子系统发育学分析,结果显示该纤毛虫序列与弗州拟尾丝虫(Parauronema virginianum)存在8个碱基的差异,序列相似性为99%,表明二者的高度相似性。在对本纤毛虫的18S rDNA序列和GenBank中报道的14种相关盾纤类纤毛虫相应序列相似性和进化距离分析的基础上,作者构建了包括迄今所有相关、已知种类的系统进化树。本研究为海水鱼类相关病害的病原鉴定提供了一份新的数据和资讯。

黄芪多糖对仿刺参非特异性免疫功能的影响

向刺参体腔中注射相同体积(500μl)的无菌黄芪多糖溶液后第1、36、d,测定体腔液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶活性及补体C3的含量,研究黄芪多糖对刺参免疫系统的影响。每头刺参多糖含量分别达0.2、0.40、.6 mg,溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶活性及补体C3含量均在注射后第3 d达到最高,且前3种指标以0.6 mg/头剂量组最高,分别达到232.25 U/ml,45.1 U/ml,966.5nkat/L;C3含量则以0.4 mg/头剂量效果最好,达到0.09 g/L。经SPSS软件分析,均与对照组差异显著(P<0.05),表明黄芪多糖具有增强刺参免疫功能的作用。

茯苓多糖对刺参体腔液中免疫因子活性的影响

采用水煎煮法提取茯苓多糖,苯酚-硫酸法测得茯苓多糖的含量为50.57%。利用分光光度技术,分析茯苓多糖对刺参体腔液中碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及补体C3含量的影响。试验组向各组刺参体腔内分别注射质量浓度为0.6、1和1.4mg/mL的茯苓多糖溶液500μL。在注射免疫增强剂后第2、4和6天,检测AKP、LSZ和SOD活性及补体C3含量。结果显示,注射后6d内,试验组刺参体腔液中LSZ活性、SOD活性、补体C3含量及AKP活性分别在第4、4、4和6天达到最高,与对照组相比,差异显著,分别为对照组的5.5倍、1.2倍、2.6倍和1.5倍。注射0.3mg茯苓多糖的刺参AKP和LSZ活性高于另外2组,注射0.5mg茯苓多糖的刺参SOD活性和补体C3含量高于另外2组。研究结果表明:茯苓多糖能提高刺参的非特异性免疫水平,可作为刺参免疫增强剂使用,有成为刺参饲料添加剂的前景。

微胶囊剂型黄芪多糖对刺参生长性能、免疫力及抗病力的影响

在基础饲料中添加不同剂量(1%、3%、5%)的微胶囊剂型黄芪多糖(Astragalus polysac-charudes,APS)(载药量为17%),制成3种配合饲料,连续投喂初始体重为22.0±1.0g的刺参Apostichopus japonicus35d,探讨微胶囊剂型黄芪多糖(以下简称"微胶囊")对刺参生长性能、非特异性免疫及抗病力的影响。结果显示,35d后刺参最高特定生长率(Specific growth rate,SGR)为0.51%/d(5%添加组)(P<0.05);微胶囊添加量为3%时免疫效果最佳,刺参体腔液中酸性磷酸酶ACP、超氧化物歧化酶SOD、髓过氧化物酶MPO活性显著高于对照组(P<0.05)。试验期间每隔7d测定刺参体腔液样品,其中ACP活性在第28天最高,为11.2U/100ml(P<0.05);SOD活性在第21天最高,为63.3U/ml(P<0.05);MPO活性在第21天最高,为40MPO单位/ml(P>0.05);免疫试验结束后对刺参进行灿烂弧菌Vibrio splendidus攻毒实验,14d内观察得出,3%微胶囊添加组累积死亡率明显低于对照组(P<0.05)。由此可得,微胶囊剂型黄芪多糖对仿刺参生长性能、免疫力及抗病力方面均具有显著的增强效果,以3%添加量效果最佳,且添加量、作用时间、免疫效果之间存在相关性。

一种水产迟钝爱德华氏菌快速药敏检测方法的研究

为了建立一种可以应用于水产养殖现场的药敏快速检测方法,以迟钝爱德华氏菌JF-1为试验菌株,在MHB培养基基础上通过添加鱼肉蛋白胨及调节无机盐离子浓度,优选了迟钝爱德华氏菌的增菌液,在此基础上利用阿尔玛蓝作为细菌生长指示剂,选择11种水产常见药物并设置了8个倍比稀释的质量浓度梯度,制备了迟钝爱德华氏菌快速药敏检测微孔板,板内设有药敏检测区、生长对照区及空白对照区。经显色法及分光光度法药敏检测试验结果比对,选定1×105个/mL菌液密度作为快速药敏检测的接菌密度,将该密度菌液接种于制备的快速药敏检测微孔板进行药敏检测,同时以分光光度法及试管稀释法检测结果作为比对,结果显示在接种12h后,显色法测定的所有药物对菌株JF-1的最小抑菌质量浓度与分光光度法完全吻合,但与接种24h后观察的稀释法在氨苄青霉素和复方新诺明两种药物的最小抑菌质量浓度上存在微小偏差。试验结果显示,本研究建立的迟钝爱德华氏菌快速药敏检测方法能够快速、简便、准确地对该菌进行药敏检测。

不同剂型的黄芪多糖在刺参养殖中的应用研究

以初始体质量为(30.0±2.0)g的刺参为研究对象,进行为期6周的投喂试验,探讨不同剂型的黄芪多糖对其生长、非特异性免疫及抗病力的影响。试验期间水温为16～20℃,溶解氧>5mg/L,分别向基础饲料(占刺参体质量的2%～4%)中添加3%的黄芪粉(100～160目)、黄芪多糖微胶囊(包封率约85%)、黄芪多糖制剂(黄芪多糖含量约63%),配制成3种试验饲料,对照组分别为基础饲料组(基础对照组)和3%海藻酸钠空白微胶囊添加组(空白对照组)。试验结束后进行刺参体腔液中相关免疫学指标的测定及致病菌感染试验。结果显示,添加3%黄芪粉、黄芪多糖制剂时,特定生长率均高于基础对照组(P>0.05),而添加3%黄芪多糖微胶囊时,特定生长率显著高于基础对照组和空白对照组(P<0.05)。添加3%黄芪粉时,刺参体腔液中各免疫指标(溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶)活性均显著高于基础对照组(P<0.05);添加3%黄芪多糖制剂时,溶菌酶、超氧化物歧化酶活性与基础对照组之间差异显著(P<0.05),碱性磷酸酶活性与基础对照组之间差异不显著(P>0.05);添加3%黄芪多糖微胶囊时,刺参体腔液中免疫指标活性较高,与基础对照组、空白对照组及其他试验组差异性均显著(P<0.05)。109cfu/mL致病菌灿烂弧菌攻毒试验结果表明,3种试验饲料均不同程度地降低试验刺参的累积死亡率,具免疫保护作用,黄芪多糖微胶囊试验组差异最显著(P<0.05)。因此,选择适宜的方式在基础饲料中添加适量的黄芪多糖可显著提高刺参特定生长率、非特异性免疫力及抗病力。

病原微生物药敏检测方法的研究进展

抗生素敏感试验在当前病原微生物耐药性持续增长的形势下,已成为指导临床科学合理用药不可或缺的重要环节。因此,药敏检测方法的完善与发展是快速获取科学、准确微生物耐药谱的前提,也是实现有效临床治疗的重要保障。本研究介绍了当前应用于微生物药物敏感检测的常规方法,如纸片扩散法、稀释法、Etest法等,简要分析了它们之间的优缺特性,并对近年来一些新兴发展的快速药敏检测方法进行了总结以及展望了不同类型药敏检测方法的发展和应用趋势。

鲍鱼常见病害初诊速查检索表

通过对我国鲍鱼主要养殖品种的细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫性疾病以及其他非生物类引起的疾病症状整理,归纳总结出18种鲍鱼常见疾病,建立起1份鲍鱼常见病害初查诊断表。本检索方式,主要采用目测或10×10～40倍显微方式观察病鲍,分析比较其特异症状,借鉴平行式生物分类检索表形式,即根据不同病害的症状表现特征,将每一对互相对应的特征编以同样的项号,并紧接并列,依次检索,建立起鲍鱼养殖期初诊简易快速检索表,并附以部分图片,以期为鲍鱼病害诊断提供新的途径。

黄芪多糖海藻酸钠微胶囊的制备及释放性能研究

通过喷雾式锐孔凝固浴方法制备黄芪多糖-海藻酸钠微胶囊,并对其影响因素进行正交优化试验,对制备的微胶囊进行体外缓释性能研究。结果显示：微胶囊平均粒径120~160目,包封率达46.3%;制备的微胶囊在5%柠檬酸钠溶液中5 h内完全释放,在模拟磷酸缓冲液中释放效果良好。制备微胶囊的最佳条件确定为2%海藻酸钠质量浓度,芯壁材比例1：4,氯化钙质量浓度3%,喷雾气压0.1 MPa,物流速度0.08 mL/s,气液高度10 cm,包埋时间0.5 h,凝固浴时间15 min。

甲氧苄氨嘧啶在牙鲆体内的药代动力学研究

健康牙鲆口服剂量为100 mg/kg的甲氧苄氨嘧啶后,利用高效液相色谱测定药物在牙鲆肌肉、血液、肾脏、肝脏质量浓度变化,并通过3P87药动学软件分析数据。试验结果表明,甲氧苄氨嘧啶在肌肉、血液、肾脏、肝脏4种组织中均符合一级吸收二室开放模型,其在上述4种组织中的达峰时间(tmax)分别为18.72、12.942、3.13 h和19.49 h;达峰质量浓度分别为13.80、18.23、32.79、27.40μg/ml;消除半衰期分别为23.64、21.471、6.72 h和15.99 h。口服甲氧苄氨嘧啶,在牙鲆体内吸收与消除较慢,血药浓度高,维持时间长。

脂多糖与β葡聚糖对迟钝爱德华氏菌亚单位疫苗的免疫促进效果研究

为了研究脂多糖与β葡聚糖对重组亚单位疫苗的协同免疫促进效果,本研究重组表达了迟钝爱德华氏菌的一个高效亚单位疫苗候选蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),利用纯化的重组GAPDH(rGAPDH)蛋白单独或混合脂多糖和β葡聚糖免疫牙鲆,免疫后通过检测牙鲆抗体水平、免疫相关基因表达及免疫保护力三方面指标变化对脂多糖和酵母β葡聚糖的免疫促进效果进行研究。ELISA结果显示:脂多糖和β葡聚糖与rGAPDH共免疫组牙鲆的抗体效价在免疫后第14和30天均显著高于单独免疫rGAPDH的牙鲆,第30天时其效价为211.76;荧光定量PCR结果显示:相比PBS对照组,牙鲆在注射免疫后脾脏组织中IL-1β、IL-6、MHC-IIα、IgM、TCRα及C型溶菌酶6种免疫相关基因表达量均出现不同程度的上调,而其中共免疫组牙鲆基因表达水平显著高于单独免疫rGAPDH的牙鲆;免疫保护性实验显示:共免疫组牙鲆在攻毒后累计死亡率显著低于对照组和单独免疫rGAPDH蛋白组,直至第14天累计死亡率为30%,相对免疫保护率为68%。研究表明:脂多糖和β葡聚糖作为疫苗免疫刺激剂使用可显著增强牙鲆的免疫应答水平,提升亚单位疫苗的免疫效果。

中国对虾和日本对虾对白斑综合征病毒(WSSV)敏感性的比较

用10^5拷贝、10^4拷贝和10^3拷贝3个剂量的白斑综合征病毒（WSSV）粗提液分别对中国对虾和日本对虾进行人工注射感染，比较两种对虾对WSSV敏感性的差异，以探讨日本对虾白斑综合征（WSS）低发病率的原因，为对虾的病害防治提供参考。结果显示：用10’拷贝、10。拷贝和10。拷贝的WSSV粗提液注射后，中国对虾的平均存活时间分别为54．21±0．60h、71．26±4．26h和75．04±5．73h；日本对虾平均存活时间分别为77．61±4．45h、105．84±6．36h和168．82±13．15h。中国对虾和日本对虾的存活时间均随着病毒剂量的降低而延长。同剂量病毒注射下，日本对虾组的存活时间均长于中国对虾组，差异显著（P〈0．05）。试验结果表明，日本对虾对WSSV的抵抗力较中国对虾强。

甲氧苄氨嘧啶在大菱鲆体内的药代动力学

健康大菱鲆口服100 mg.kg-1(鱼体重)甲氧苄氨嘧啶(TMP)后,利用高效液相色谱仪测定TMP在大菱鲆肌肉、血液、肾脏、肝脏含量的变化,并用3P87药代动力学软件分析药代动力学参数.结果表明:TMP在肌肉、血液、肾脏、肝脏4种组织中的含量—时间数据均符合一级吸收二室开放模型,达峰时间分别为18.32、16.19、25.36、13.64 h,达峰含量分别为35.05、38.16、34.75、38.32μg.mL-1,消除半衰期分别为45.11、40.32、36.68、48.75 h.可见,在口服条件下,TMP在大菱鲆体内的吸收与消除较慢,含量高,维持时间长.

扇贝常见病害诊断速查检索表

从扇贝常见病害的主要症状入手,通过对病害症状特异性的比较,采用生物分类检索表的形式,建立了扇贝养殖病害快速检索表,以期为及时正确地诊断扇贝病害提供参考。

微囊化小肽对刺参免疫酶活力的影响

利用微胶囊技术对小肽进行包埋,制成不溶于水的微囊化小肽投喂刺参。根据水溶性肽测定方法,测得微囊化小肽的载药量为21.0%。研究了口服不同剂量微囊化小肽对刺参酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响。在基础饲料中分别添加微囊化小肽1.0%、3.0%和空白微胶囊(不含小肽)1.0%、3.0%,以基础饲料饲喂组为对照,饲喂7d。于投喂结束后第2、7和14天检测ACP、AKP与SOD活力。结果显示,投喂空白微胶囊组的酶活力与对照组差异不显著(P>0.05),而投喂微囊化小肽1.0%、3.0%组的酶活力均显著提高,与对照组相比存在显著差异(P<0.05),且微囊化小肽3.0%组的效果最优,其ACP、AKP与SOD活力分别在投喂后第7、7、2天达到最高值,是对照组的190%、380%、210%。解决了刺参摄食较慢,小肽较易溶于水而无法用传统方法给药的问题,有效增强了刺参机体的免疫力。研究结果表明,微囊化小肽可以作为刺参免疫增强剂使用,有成为刺参饲料添加剂的前景。

致病性灿烂弧菌的分离鉴定及药敏特性研究

[目的]分离鉴定患病刺参(Apostichopus japonicus)的致病茵,并研究其药敏特性。[方法]从患病的刺参体内分离出1株致病菌W-1。通过微量生化鉴定管和菌体常规形态特征、生理生化反应指标测定以及16S rRNA测序分析等进行综合鉴定;再通过人工感染健康刺参测定该菌株对其的半数致死量(LD50);最后进行药敏试验确定其药敏特性。[结果]致病菌W-1为革兰氏阴性菌,菌落呈米色,边缘光滑,中间略有隆起。序列分析结果显示,该菌株与灿烂弧菌的亲缘关系最近,相似率达99.8%,综合鉴定该菌为灿烂弧菌(Vibrio splendidus)。该菌对苯唑青霉素、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢呋新、菌必治、先锋必素、麦迪霉素、氟哌酸、环丙沙星、万古霉素、痢特灵、丁胺卡那、庆大霉素、强力霉素、氯洁霉素等抗生素高度敏感,对氨苄青霉素、羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、复达欣、新霉素、四环素等药物中度敏感。[结论]该研究对防治由灿烂弧菌引起的海水养殖动物疾病具有积极意义。